摘要
目的 随着生活水平的提高，女性肥胖，2 型糖尿病等胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)相关疾病发病率日益提高。反复植入失败(Recurrent Implantation Failure，RIF)的发生率也随之升高。本研究拟使用生信分析结合动物模型与临床资料分析综合探索胰岛素样生长因子结合蛋白 2（Insulin-like Growth Factor Binding Protein，IGFBP2）对子宫内膜蜕膜化及妊娠结局的影响。试图通过 IGFBP2 将 IR 与生育年龄妇女妊娠结局联系起来，为 IR患者临床辅助生殖治疗疗效提供可靠的预测或评价指标。本项目拟探索 IR对母胎界面局部IGFBP2表达的影响，试图为IR影响子宫内膜蜕膜化及妊娠结局的分子机制研究做铺垫。 方法 1.采用 WGCNA 分析筛选得到 RIF 子宫内膜基因差异表达基因,LIMMA 分析得到多囊卵巢综合征同时合并胰岛素抵抗(Polycystic Ovary Syndromeamp;insulin resistance，PCOSamp;IR)患者的差异表达基因。利用 GO 和KEGG 对 PCOSamp;IR 差异基因进行功能解析。通过 MsigDB 数据库及GeneCards 数据库得到胰岛素抵抗及胰岛素样生长因子结合通路(Insulin Resistanceamp;Insulinamp;like Growth Factors,IRamp;IGFs)相关基因集、子宫内膜蜕膜化(Decidualization)相关基因集。绘制韦恩图将上述四个基因集取交集得到核心基因。利用 GEO 数据库验证 IGFBP2 在 PCOS 患者子宫内膜中的表达。最后利用HPA数据库及DISCO单细胞测序数据分析母胎界面中IGFBP2的表达。 2.C57BL/6J 雌鼠（ n=30 ）分别喂养高脂饮食、正常饮食建立 IR 组（N=15）、对照组（N=15）。造模第 8 周后通过检测一系列糖脂代谢的指标筛选出 IR的雌鼠。造模第 10周通过阴道涂片监测小鼠动情周期。造模第12 周后进行小鼠合笼。测定两组小鼠妊娠第 12 天的胚胎及胎盘的重量。为了研究小鼠胚胎着床过程中子宫内膜的变化，先对妊娠第 7 天子宫切片，后进行 IGFBP2 免疫组化染色、HE 染色、CD31 免疫荧光、MASSON 染色。通过 RT-qPCR 评估胰岛素样生长因子家族分子及 PRL 在两组小鼠妊娠第 7天子宫中的基因表达。通过 WB 检测子宫内膜蜕膜化相关分子：MMP-2、COX-2、TGF-β、VEGFB、BCL-2 及胰岛素样生长因子家族相关分子：IGFBP2、IGFBP1、IGF-2在两组小鼠妊娠第7天子宫中的表达。 3.临床研究主要收集2022年2月到2022年12月南通大学附属医院生殖医学中心拟行冻胚移植（Frozen embryo transfer，FET）治疗的 86 例患者，均完善移植前建档。收集患者的一般资料、子宫内膜转化及移植胚胎相关指标、妊娠结局等资料。按照胰岛素代谢将患者分为 IR 组 36 例和对照组 50例。收集子宫内膜转化当天及胚胎移植术后 10 天的外周血血清，ELISA 分别测定其中 IGFBP2 的水平。对比两组患者一般资料、子宫内膜转化、移植胚胎相关指标及妊娠结局是否存在差异。 结果 1.综合生物信息学方法筛选出 PCOSamp;IR 及 RIF 的共同差异基因IGFBP2、IGF-2。关注到IGFBP2作为分泌型蛋白,在体内分布广泛，与多种信号通路产生关联。通过GEO数据库验证发现，IGFBP2在PCOS患者增殖期子宫内膜的基质成纤维细胞中表达下降。单细胞测序数据库显示 IGFBP2在母胎界面的成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞中表达相对较高。 2.IR组小鼠的体重、lee''s指数、空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数、血脂升高，证明 IR 小鼠模型构建成功。与对照组相比，IR 组小鼠动情周期紊乱，妊娠第 7天血清中睾酮水平升高，但妊娠第 7天血清 IGFBP2水平下降。IR组小鼠妊娠第7天胚胎着床位点数及妊娠第12天胚胎重量下降。HE染色、MASSON染色、IGFBP2免疫组化及CD31免疫荧光显示IR组妊娠第7天子宫子宫内膜蜕膜化受损。RT-qPCR实验表明小鼠妊娠第7天子宫中IGFBP1、IGFBP2、IGF-2的mRNA表达降低。蛋白WB实验表明与胰岛素样生长因子家族分子：IGFBP1、IGFBP2、IGF-2在 IR组表达下降，同时子宫内膜蜕膜化相关分子：MMP-2、COX-2、TGF-β、VEGFB、BCL-2 在IR组的表达同样下调。 3.IR组患者的一般资料中BMI、空腹血糖、血清尿酸高于对照组。分析子宫内膜转化日及胚胎移植相关临床指标发现， IR 组转化日血清 IGFBP2 17.44±1.46 ng/ml 显著低于对照组 18.32±1.41ng/ml（P＜0.01）。IR 组胚胎移植后 10 天血清 IGFBP2 18.31±1.17 ng/ml 低于对照组 19.07±1.88ng/ml（P＜0.05）。无论是 IR组还是对照组，对比移植后 10天血清中 IGFBP2水平相比于转化日均有提高。尽管两组间临床妊娠结局并无统计学差异，在数值上 IR组的临床妊娠率及活产率要低于对照组，而 IR组的流产率在数值上要高于对照组。ROC曲线提示转化日血清IGFBP2对FET临床妊娠是否活产有一定的预测价值。 结论 IR 状态可能通过阻碍子宫内膜蜕膜化、影响蜕膜血管生成、细胞凋亡等多种途径干扰胚胎着床，最终导致 RIF 及不良妊娠结局。IGFBP2 通过结合 IGF-2 激活下游多种信号通路调节细胞分化凋亡、蜕膜血管生成、胚胎发育。IGFBP2在预测FET患者临床妊娠活产方面有一定价值。
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