摘要
背景 锂(Lithium，Li)是一种广泛应用于新型锂电池行业和临床治疗的金属，广 泛存在于食品和饮用水中。人群通过职业暴露、服用含锂药物以及摄入食物和饮 用水等途径暴露于锂。 目前锂的免疫毒性研究主要聚焦在药物治疗浓度(服用含锂药物人群的血清 锂浓度为3～7 mg/L)和更高浓度的锂对免疫系统的影响。临床治疗剂量的锂可 以调节免疫细胞功能，锂对免疫系统的影响较为复杂。锂的职业暴露水平通常低 于临床治疗水平。锂是一种潜在的职业性污染物，但目前职业性锂暴露对免疫系 统的影响是未知的。 造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSC)具有自我更新能力，能够维持 自身数量恒定并分化生成所有种类血细胞。在生理状态下，一小部分HSC增殖 并分化为成熟血细胞，大多数HSC在骨髓中静息。在造血发生过程中，HSC分 化为共同髓系祖细胞(common myeloid progenitors，CMP)、共同淋巴系祖 细胞(common lymphoid progenitors,CLP)和巨核-红系祖细胞(megakaryocyte- erythrocyte progenitors，MEP)，这些祖细胞分别进一步分化生成成熟的髓系细 胞、淋巴细胞和血小板/红细胞。HSC能够影响整个免疫系统，因此，HSC对机 体的造血系统和免疫系统至关重要。HSC功能障碍包括分化受阻导致成熟细胞 数量下降、分化增生引起成熟细胞数量过多和分化紊乱导致淋巴系细胞/髓系细 胞比例异常等。 HSC的主要功能是分化生成成熟免疫细胞和红细胞/血小板，骨髓中HSC的 增殖与分化受到严格的调控。大多数HSC在骨髓的niche中处于静息状态，蛋白 质合成水平较低，因此HSC中ER stress的水平相对较低。适当水平的内质网应 激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)对 HSC 的功能至关重要，ER stress 在HSC调控中的作用比较复杂。此外，Hsp90是一种与ER stress密切相关的分 子，对HSC稳态起到重要作用。 目前，锂对HSC的影响及相关机制是未知的。本课题的目的是研究锂对HSC 的影响及其机制，是对锂的免疫毒性研究的重要开拓，具有重要的公共卫生意义。 第一部分 锂对小鼠骨髓HSC分化功能和静息性的影响 目的:探索锂对小鼠骨髓HSC分化功能和静息性的影响 方法:(1)检测染毒小鼠血清锂浓度和免疫细胞数量:将无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)级、6-8周龄的C57BL/6(B6)小鼠随机分成对照组、50ppm 氯化锂染毒组与200ppm氯化锂染毒组，经自由饮水染毒3个月后，利用原子吸 收光谱法检测小鼠血清锂浓度，利用流式细胞仪检测小鼠脾脏、外周血与骨髓中 淋巴细胞和髓系细胞的数量以及小鼠骨髓中HSC、造血祖细胞的数量。（2）建 立混合骨髓嵌合模型小鼠，检测受体小鼠体内成熟免疫细胞以评价HSC功能: 采用CD45.1型小鼠、CD45.2型小鼠以及B6小鼠，其中CD45.1型小鼠和CD45.2 型小鼠作为供体小鼠，B6小鼠作为受体小鼠。CD45.1型小鼠给予正常饮水; CD45.2型小鼠随机分成对照组与200 ppm氯化锂染毒组，经自由饮水染毒3个 月。3个月后，将CD45.1型小鼠的骨髓细胞与CD45.2型小鼠的骨髓细胞取出， 并以1∶1比例混合。给予B6受体小鼠5Gy+5Gy致死性照射，摧毁其免疫系 统后，将混合骨髓细胞通过静脉注射转移至其体内，构建骨髓嵌合模型小鼠。4 个月后，供体细胞在受体小鼠体内充分重建免疫系统，利用流式细胞仪检测受体 小鼠脾脏与外周血中各类成熟免疫细胞并计算其中CD45.2+细胞所占的比例。（3） 建立混合HSC/骨髓嵌合模型小鼠，检测受体小鼠体内成熟免疫细胞以评价HSC 功能:采用CD45.1型小鼠、CD45.2型小鼠以及B6小鼠，其中CD45.1型小鼠 和CD45.2型小鼠作为供体小鼠，B6小鼠作为受体小鼠。CD45.1型小鼠给予正 常饮水;CD45.2型小鼠随机分成对照组与200 ppm氯化锂染毒组，经自由饮水 染毒3个月。3个月后，利用流式细胞术将CD45.2型小鼠骨髓中的HSC分选出 来，与CD45.1型小鼠的骨髓细胞以1∶500比例混合。给予B6受体小鼠5Gy+ 5 Gy致死性照射，摧毁其免疫系统后，将混合HSC/骨髓细胞通过静脉注射转移 至其体内，构建HSC/骨髓嵌合模型小鼠。4个月后，供体细胞在受体小鼠体内充 分重建免疫系统，利用流式细胞仪检测受体小鼠脾脏与外周血中各类成熟免疫细 胞并计算其中CD45.2+细胞所占的比例。（4）检测染毒小鼠骨髓HSC分化功能 和静息性:B6小鼠经饮水染毒3个月后，利用PCR检测骨髓HSC中淋巴系分 化相关基因hhex和髓系分化相关基因cebpa的mRNA水平，利用流式细胞仪检 测小鼠骨髓HSC处于SG2M期的比例，通过分裂增殖情况评价其静息性。 结果:（1）染毒小鼠血清锂浓度和免疫细胞数量:对照组小鼠血清中未检出锂 存在，50 ppm氯化锂染毒组小鼠血清锂浓度为0.19 mg/L,200 ppm氯化锂染毒 组小鼠血清锂浓度为0.50 mg/L。200 ppm氯化锂染毒增加小鼠脾脏和外周血中 B细胞、T细胞和骨髓中B细胞的数量，减少小鼠脾脏、外周血和骨髓中单核细 胞和中性粒细胞的数量，减少小鼠骨髓中HSC、CMP和GMP的数量，增加小 鼠骨髓中CLP的数量。50ppm氯化锂染毒未产生以上效应。（2）混合骨髓嵌合 模型:200 ppm氯化锂染毒组受体小鼠脾脏与外周血的各类免疫细胞中CD45.2+ 细胞所占的比例较对照组降低。（3）混合HSC/骨髓嵌合模型:200ppm氯化锂 染毒组受体小鼠脾脏与外周血的白细胞、B细胞和T细胞中CD45.2+细胞所占的 比例较对照组升高，单核细胞和中性粒细胞中CD45.2+细胞所占的比例较对照组 没有显著变化。（4）染毒小鼠骨髓HSC分化功能和静息性:200ppm氯化锂染 毒增加小鼠骨髓HSC中hhex的mRNA水平，不影响cebpa的mRNA水平，减 少小鼠骨髓HSC处于SG2M期的比例，50ppm氯化锂染毒无此效应。 结论:锂使小鼠脾脏、外周血和骨髓中淋巴细胞数量增加，髓系细胞数量减少, 使小鼠骨髓中HSC、CMP和GMP数量减少，CLP数量增加。锂增强小鼠HSC 淋巴系分化潜能，抑制HSC分裂增殖。 第二部分 锂影响小鼠骨髓HSC的机制 目的:探索锂影响小鼠骨髓HSC的机制 方法:（1）锂对小鼠HSC中ER stress的影响及其在HSC分化功能和静息性中 的作用:将B6小鼠随机分成对照组与200ppm氯化锂染毒组，经饮水染毒3个 月后，利用流式细胞仪和共聚焦成像检测小鼠骨髓HSC中ERstress相关分子的 表达，利用PCR检测ERstress相关分子基因的mRNA水平。在体外实验中，利 用流式细胞分选出正常饮水小鼠骨髓HSC,体外采用含有氯化钠对照或氯化锂 的培养基培养12小时后，利用流式细胞仪和共聚焦成像检测HSC中ER stress 相关分子的表达。在体外干预实验中，采用含有氯化钠对照、含有氯化锂或含有 氯化钠和ER stress抑制剂的培养基对HSC进行体外培养12小时后，利用PCR 检测HSC中hhex和cebpa的mRNA水平,利用流式细胞仪检测HSC处于SG2M 期的比例。（2）锂对小鼠HSC中Hsp90的影响及ER stress与Hsp90之间的调 控关系:将B6小鼠随机分成对照组与200 ppm氯化锂染毒组，饮水染毒3个月， 利用流式细胞仪和共聚焦成像检测小鼠骨髓HSC中Hsp90的表达，利用PCR检 测HSC中hsp90的mRNA水平。在体外实验中，体外采用含有氯化钠对照或氯 化锂的培养基培养正常饮水小鼠的骨髓HSC 12小时后，利用流式细胞仪和共聚 焦成像检测HSC中Hsp90的表达，利用PCR检测HSC中hsp90的mRNA水 平。在体外干预实验中，采用含有氯化钠对照、含有氯化锂、含有氯化钠和ER stress抑制剂或含有氯化锂和ER stress激动剂的培养基对HSC进行体外培养12 小时后，利用流式细胞仪检测HSC中Hsp90的表达，利用PCR检测HSC中 hsp90的mRNA水平。（3）锂增加小鼠HSC中Hsp90的表达对HSC分化功能 的影响:在骨髓转移实验中，建立混合HSC/骨髓嵌合模型小鼠，采用CD45.1型 小鼠、CD45.2型小鼠以及B6小鼠，其中CD45.1型小鼠和CD45.2型小鼠作为 供体小鼠，B6小鼠作为受体小鼠。CD45.1型小鼠和CD45.2型小鼠均正常饮水。 利用流式细胞分选出CD45.2型小鼠骨髓中的HSC,体外采用含有氯化钠对照、 含有氯化锂或含有氯化锂和Hsp90抑制剂的培养基培养12小时后，与CD45.1 型小鼠的骨髓细胞以1∶500比例混合。给予B6受体小鼠5Gy+5Gy致死性照 射，摧毁其免疫系统后，将混合HSC/骨髓细胞通过静脉注射转移至其体内，构 建HSC/骨髓嵌合模型小鼠。4个月后，供体细胞在受体小鼠体内充分重建免疫 系统，利用流式细胞仪检测受体小鼠脾脏与外周血中各类成熟免疫细胞并计算其 中CD45.2+细胞所占的比例。在体外干预实验中，体外采用含有氯化钠对照、含 有氯化锂或含有氯化锂和Hsp90抑制剂的培养基培养正常饮水小鼠的骨髓HSC 12小时后，利用PCR检测HSC中hhex和cebpa的mRNA水平，利用流式细胞 仪检测HSC处于SG2M期的比例。 结果:（1）小鼠经饮水染毒3个月后，200 ppm氯化锂染毒降低小鼠骨髓HSC 中p-IRE1、XBP1s和p-PERK的表达，降低小鼠骨髓HSC中xbp1s和hspa5的 mRNA水平。体外实验中，氯化锂降低小鼠HSC中p-IRE1和p-PERK的表达。 体外干预实验中，氯化锂及ER stress抑制剂均增加HSC中hhex的mRNA水平， 不影响cebpa的mRNA水平，减少小鼠骨髓HSC处于SG2M期的比例。（2） 小鼠经饮水染毒3个月后，200 ppm氯化锂染毒增加小鼠骨髓HSC中Hsp90以 及hsp90的mRNA的水平。体外实验中，氯化锂增加小鼠HSC中Hsp90以及 hsp90的mRNA的水平。体外干预实验中，氯化锂及ER stress抑制剂均增加HSC 中Hsp90与hsp90的mRNA水平，氯化锂处理的同时给予ER stress激动剂降低 Hsp90的表达。（3）在骨髓转移实验中，氯化锂处理组受体小鼠脾脏与外周血的 白细胞、B细胞和T细胞中CD45.2+细胞所占的比例较对照组升高，氯化锂处理 的同时给予Hsp90抑制剂组白细胞、B细胞和T细胞中CD45.2+细胞所占的比例 较氯化锂处理组降低，三组受体小鼠脾脏与外周血的单核细胞和中性粒细胞中 CD45.2+细胞所占的比例没有显著变化。体外干预实验中，氯化锂处理增加HSC 中hhex的mRNA水平，氯化锂处理的同时给予Hsp90抑制剂较氯化锂处理降低 HSC中hhex的mRNA水平，氯化锂处理及Hsp90抑制剂处理不影响HSC中 cebpa的mRNA水平。Hsp90抑制剂处理没有恢复氯化锂引起的小鼠骨髓HSC 处于SG2M期比例降低。 结论:锂抑制小鼠骨髓HSCERstress信号，一方面抑制HSC分裂，另一方面增 强Hsp90表达，进而增强HSC的淋巴系分化潜能。 第三部分 锂对人HSC样本的影响及其机制 目的:探索锂对人HSC样本的影响及其机制 方法:招募12名健康志愿者，收集其外周血，利用流式细胞分选出外周血中的 HSC,体外采用含有氯化钠对照或氯化锂的培养基培养12小时后，利用流式细 胞仪检测HSC中Hsp90的表达以及HSC处于SG2M期的比例，利用共聚焦成 像检测HSC中Hsp90和p-IRE1的表达，利用PCR检测HSC中hhex和cebpa 的mRNA水平。在体外干预实验中，体外采用含有氯化钠对照、含有氯化锂、 含有氯化钠和ER stress抑制剂、含有氯化锂和ER stress激动剂或含有氯化锂和 Hsp90抑制剂的培养基培养12小时后，利用PCR检测HSC中hsp90、hhex和 cebpa的mRNA水平，利用流式细胞仪检测HSC处于SG2M期的比例。 结果:体外氯化锂处理使人HSC中Hsp90的表达增加，p-IRE1的表达减少，hhex 的mRNA水平升高，不影响人HSC中cebpa的mRNA水平，降低人HSC处于 SG2M期的比例。体外干预实验中，氯化锂和ER stress抑制剂均增加人HSC中 hsp90和hhex的mRNA水平。氯化锂处理的同时给予ER stress激动剂消除了氯 化锂引起的人HSC中hsp90和hhex的mRNA水平升高。氯化锂处理的同时给 予Hsp90抑制剂消除了氯化锂引起的人HSC中hhex的mRNA水平升高。氯化 锂和ER stress抑制剂均降低HSC处于SG2M期的比例，氯化锂处理的同时给予 ER stress激动剂恢复了氯化锂引起的HSC处于SG2M期的比例降低。 结论:锂抑制人HSCERstress信号，一方面抑制HSC分裂，另一方面增强Hsp90 表达，进而增强HSC的淋巴系分化潜能。
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