摘要
研究背景 宫颈癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一。放疗是局部晚期宫颈癌的标准治疗模式。尽管放疗技术的不断精进明显提高了局部晚期宫颈癌的肿瘤局控率和盆腔病灶控制率，但并没有显著改善患者的生存期。因此，亟需探寻放疗抵抗的分子机制及放疗增敏新靶点。本课题旨在探寻驱动宫颈癌放疗抵抗演变的关键分子，及其促进宫颈癌放疗抵抗的调控机制，为临床放疗增敏提供新靶点。 研究方法 通过阶梯辐照构建放疗抵抗演变细胞模型，采用克隆形成、流式凋亡、细胞周期检测、TUNEL染色等方法评估放疗敏感性与药物增敏作用。运用转录组测序（RNA-seq）及非靶向代谢组学检测，分析放疗抵抗衍变过程中的生物学特征。通过RNA-seq联合染色质开放性测序（ATAC-seq）筛选驱动宫颈癌放疗抵抗衍变的转录因子。采用CCK-8测定细胞活力和WesternBlot检测DNA损伤修复标志物评估对Erastin诱导的铁死亡敏感性，用ROS探针染色、脂质氧化产物MDA与抗氧化物GSH含量测定、BODIPY581/591C11脂质过氧化探针染色评估放疗抵抗细胞与敲低E2F7的细胞经Erastin或电离辐射处理后的脂质过氧化水平。染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）联合RNA-seq寻找E2F7的下游靶分子后，经双荧光素酶报告基因系统和启动子区ChIP-qPCR验证其转录调控，并经下游分子抑制与回补实验，验证该分子调控放疗抵抗与铁死亡表型。所有的RNA测序数据及过表达、敲减稳转株构建均由qPCR和WesternBlot进行验证。最后通过裸鼠皮下成瘤，计算灌胃药物增敏放疗的生长曲线、经免疫组化染色等方法，检测增殖、DNA损伤等指标表达水平以评估药效。 结果 转录组结合代谢组学分析发现，在宫颈癌放疗抵抗演变过程中，发生以不饱和脂肪酸选择性重塑为主的脂质代谢重编程，主要表现为单不饱和脂肪酸的富集，而多不饱和脂肪酸合成代谢进行性减少;相比于糖酵解抑制剂和谷氨酰胺抑制剂，脂肪酸抑制剂更能增强放疗抵抗细胞的电离辐射损伤。通过染色质开放性测序联合转录组测序分析，筛选出转录因子E2F7在放疗抵抗进程中进行性下调;在放疗敏感细胞中敲低E2F7可以复现放疗抵抗与脂肪酸代谢重编程，且脂肪酸抑制剂可以逆转敲低E2F7介导的放疗抵抗，提示E2F7通过重塑脂肪酸代谢调控宫颈癌放疗抵抗演变。RNA-seq测序数据提示，敲低E2F7减少细胞内铁死亡通路富集;且放疗抵抗及敲低E2F7的宫颈癌细胞对Erastin和放疗诱导的铁死亡敏感性降低、脂质过氧化水平减少，提示E2F7通过调控铁死亡介导放疗敏感性。机制上，转录因子E2F7可以识别并结合ACSL4的启动子区域，其表达下调抑制ACSL4基因转录，进而减少多不饱和脂肪酸在膜脂上的整合，获得铁死亡依赖的放疗抵抗。最后，在体内与体外实验中发现补充单不饱和脂肪酸降低放疗敏感性，而补充多不饱和脂肪酸可增敏放疗。 结论 本课题阐明放疗抵抗演变过程中转录因子E2F7进行性下调，一方面通过调控不饱和脂肪酸代谢重编程，减少铁死亡底物;另一方面通过抑制ACSL4转录,减少多不饱和脂肪酸的酯化与细胞膜重塑，进而驱动宫颈癌细胞铁死亡依赖的放疗抵抗。本研究提出脂肪酸合成抑制剂及补充多不饱和脂肪酸在逆转或延缓宫颈癌放疗抵抗演变中的作用，为实现宫颈癌放疗增效提供新靶点和新方案。
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