摘要
苦豆子(Sophora alopecuroides)为豆科槐属多年生草本植物，是荒漠草原重要的先锋植被之 一。苦豆子全草可入药，主要有效成分是喹诺里西啶类生物碱，包括槐定碱、氧化苦参碱、苦参 碱、槐果碱和氧化槐果碱等，具有抗肿瘤、抗病毒等多种药理功效。在植物病虫害生物防治中， 具有杀菌抗虫等活性。现阶段，喹诺里西啶类生物碱的提取主要来源于野生苦豆子植株，但苦豆 子野生资源有限，过度采收将导致大量天然草场退化，严重威胁着草地的生态平衡。人工栽培苦 豆子存在发芽率低、生长缓慢、成本较高，且有效成分活性降低等问题，难以满足药用市场对苦 豆子的大量需求。研究表明，植物中普遍存在内生真菌，诸多菌株能够产生与宿主植物相同或相 近的活性物质。若从苦豆子中筛选出能够产生喹诺里西啶类生物碱的内生真菌，并利用真菌发酵 和生物合成策略提高有效成分产量，将为野生苦豆子资源的合理利用和西部生态保护提供新的途 径。因此，本研究以从宁夏盐池县花马池镇天然草场采集的苦豆子中分离的纯化内生真菌菌株为 材料，开展了以下研究: 1.通过改进喹诺里西啶类生物碱酸性染料比色法，优化反应条件。结果表明:酸性染料比色 法测定生物碱含量，其最佳显色条件:pH=6.0,显色溶液为0.8783 mg·mL-1的溴甲酚绿2mL, 萃取液为二氯甲烷5mL。确定喹诺里西啶类生物碱在0.0098～0.625 mg·mL-1浓度范围内与吸光度 呈良好线性关系 y=4.2761x-0.0146(R2=0.9990)。 2.以前期从苦豆子中分离纯化的20株内生真菌菌株为材料，采用生物碱沉淀法、高效液相 色谱法和酸性染料比色法进行产生物碱菌株的筛选，对获得的高活性产生物碱菌株进行形态学和 多基因序列比对分析，确定其分类地位。结果表明:从20株苦豆子内生真菌菌株中筛选得到1 株高活性产槐定碱菌株HY17,将其鉴定为新种苦豆子无毛毛壳菌（Achaetomium sophora),其菌 丝中槐定碱的含量为0.431 mg·mL-1,产碱率为0.862 mg·g-1。 3.为了进一步提高苦豆子无毛毛壳菌HY17的产碱率。采用单因素试验、Plackett-Burman(PB) 试验、最陡爬坡试验、响应面(Box-Behnken)试验对菌株HY17发酵培养条件进行优化。结果 表明:SDY液体培养基，初始pH=6、天数为8d、碳源为玉米粉、氮源为干酪素的条件为菌株 HY17产槐定碱的最佳发酵条件。L-赖氨酸、L-哌啶酸和苯丙氨酸3个因素对发酵效果的影响最 为显著。优化后在L-赖氨酸为1.044g·L-1,L-哌啶酸为0.081 g·L-1,苯丙氨酸为1.995 g·L-1时， 产碱率达到最大为1.362mg·g-1,与原始发酵条件相比，优化后产碱率提高了 48.36％。 4.以菌株HY17为出发菌株，分别采用插入突变、紫外辐照物理诱变、亚硝基胍化学诱变、 物理与化学复合诱变的4种诱变方式，在不同诱变时间、诱变剂量等条件下对其进行了诱变筛 选研究。结果表明:通过T-DNA插入突变，筛选出10株产碱率显著增加的菌株，其中HY17-A6 菌株产碱率最高为1.372 mg·g-1，比野生型增加了 20.45％;通过紫外辐照诱变，筛选出3株产 碱率显著增加的菌株，其中HY17-B27菌株产碱率最高为1.125 mg·g-1,比野生型增加了 14.32％; 通过亚硝基胍化学诱变，筛选出6株产碱率显著增加的菌株，其中HY17-C28菌株产碱率最高 为 1.442 mg·g-1,比野生型增加了 39.86％;通过紫外与亚硝基胍复合诱变，筛选出14株产碱率 显著增加的菌株，其中HY17-D5菌株产碱率最高为1.522 mg·g-1,比野生型增加了 56.91％。
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