摘要
苦豆子是宁夏特色耐盐碱的药用植物，蕴含丰富的抗逆基因资源，对改良宁夏河套地区盐碱化问题具有重要意义和发展前景。苦豆子赖氨酸脱羧酶（LysineDecarboxylase,SaLDC）是其主要药用成分喹诺里西啶类生物碱合成途径的第一个酶，催化赖氨酸脱羧生成尸胺，是决定苦豆子药材品质的关键酶。课题组前期研究发现盐胁迫影响了苦豆子氧化苦参碱含量的积累，参与该次生代谢途径的SaLDC基因受盐胁迫诱导表达升高。本研究以异源过表达SaLDC的转基因拟南芥植株为研究对象，通过表型观察与生理生化指标检测，分析其在种子萌发期和幼苗生长期对不同浓度NaCl胁迫的响应能力，初步验证SaLDC基因的生物学功能。再以150mMNaCl处理7天的转基因幼苗为材料，通过转录组和代谢组学联合分析，深入解析SaLDC在盐胁迫响应过程中的分子机制。主要结果如下: 1、通过荧光定量PCR实验选择了三个SaLDC表达量梯度依次升高的拟南芥过表达T3代植株，表达量由低到高依次是SaLDC-OE4、SaLDC-OE8和SaLDC-OE2。研究发现，正常生长条件下，SaLDC过表达拟南芥植株具有早花、单株产量高的特点，且和SaLDC的表达剂量成正相关。具体表现为土培条件下SaLDC-OE2生长25天即可开花，而Col野生型至少生长32天才能开花。SaLDC过表达拟南芥单株果荚数量、长度、宽度和千粒重都比野生型具有显著优势。 2、通过对培养皿上SaLDC过表达拟南芥种子的萌发表型和种子活力指标测定发现，在MS培养基生长条件下，过表达SaLDC植株的冠部鲜重高于野生型，而根平均长度、根平均体积与野生型无显著性差异。随着NaCl浓度的增加，根生长相关生理指标，包括长度、平均投影面积、表面积和体积共四个指标均呈下降趋势，而根平均直径则变化不显著。在NaCl浓度为80mM、100mM、120mM时SaLDC过表达拟南芥和野生型相比未有明显表型差异;在NaCl浓度达到150mM时，SaLDC过表达拟南芥的种子表现出耐盐的表型，种子发芽势、发芽率、根长、根平均投影面积、根表面积和根体积显著性高于野生型植株，且这些表型性状和SaLDC基因表达量成剂量效应，即在拟南芥中，SaLDC基因表达量越高的株系在种子萌发阶段越耐盐胁迫。当NaCl浓度达到200mM时，野生型种子无法萌发,但SaLDC-OE2株系仍然能够维持着9.35％的萌发率，可见过表达SaLDC的拟南芥种子在萌发期能够显著耐受盐胁迫。 3、进一步研究发现，在正常生长条件下，SaLDC过表达拟南芥植株冠部鲜重、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢（H2O2）均显著高于野生型，而冠部叶绿素、叶片含氮量、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量与野生型相比均没有显著性差异。在盐胁迫条件下，随着胁迫天数的增加，SaLDC过表达拟南芥冠部鲜重、叶绿素、叶片含氮量、POD、CAT、SOD、H2O2、MDA含量呈现先升高后降低的趋势，而Pro含量呈现持续上升趋势;与野生型相比，SaLDC过表达拟南芥冠部鲜重、叶绿素、叶片含氮量、POD、CAT、SOD以及Pro含量上升程度显著性高于野生型，而H2O2、MDA含量上升程度显著性低于野生型，说明过表达SaLDC的拟南芥植株在盐胁迫条件下具有强大的抗氧化酶系统，能够降低植物细胞的H2O2和MDA含量，缓解盐胁迫对植株的伤害。 4、正常条件下，SaLDC过表达拟南芥植株的K+、Ca2+和Na+/K+含量与野生型相比无显著性差异，而Na+低于野生型，Mg2+高于野生型。在150mMNaCl处理7天后，SaLDC过表达拟南芥植株与野生型相比，K+、Na+和Na+/K+显著降低，Ca2+和Mg2+显著升高。可见盐胁迫下SaLDC对维持植株体内低Na+/K+,高Ca2+和Mg2+离子稳态具有重要作用。正常条件下，和野生型相比，SaLDC过表达拟南芥植株具有较高的精胺、亚精胺、腐氨和尸胺含量，但在150mMNaCl胁迫下，SaLDC过表达拟南芥植株只有尸胺含量有显著性降低。 5、通过转录组学和代谢组学分析发现，和抗氧化系统以及生物碱合成相关的一些基因和代谢物可以维持细胞功能，这对植物在盐胁迫下的生理稳定至关重要。黄酮类、酚类、甜菜碱、脯氨酸等能够发挥渗透作用，维持细胞内外渗透压平衡，抵抗盐胁迫的损害。
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