摘要
美国白蛾（Hyphantria cunea）是一种多食性检疫害虫，被中国列为重点管控的外来入侵物种。寄主范围广是美国白蛾危害严重、防治困难的主要原因之一。然而，当前对美国白蛾多寄主适应性形成的生理和分子机制研究甚少。本研究以美国白蛾幼虫及其不同喜食性寄主植物家榆（Ulmus pumila）、水曲柳（Fraxinus mandshurica）、桑（Morus alba ）、胡桃楸（ Juglans mandshurica ）、白桦（ Betula platyphylla ）、紫椴（ Tilia amurensis）和山槐（Albizia kalkora）为研究对象，围绕羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）解毒酶家族，利用RT-qPCR、RNAi、转基因果蝇及昆虫杆状病毒异源表达系统等技术阐明美国白蛾多寄主适应性形成的生理和分子基础。同时，构建了以关键解毒基因dsRNA和纳米材料壳聚糖（CS）为基础的核酸农药，用于紊乱美国白蛾幼虫的多寄主适应能力，为美国白蛾的绿色防治提供了技术支撑。主要研究结果如下： （1）初步筛选HcCarE6和HcGSTs1为介导美国白蛾多寄主适应性形成的关键解毒基因。美国白蛾幼虫CarE和GST酶活性对不同寄主植物的响应趋势为低（紫椴、山槐）喜食性寄主植物处理组＞中（胡桃楸、白桦）喜食性寄主植物处理组＞高（家榆、水曲柳、桑）喜食性寄主植物处理组。CarE酶活抑制剂或GST酶活抑制剂处理后，不同寄主植物处理组中美国白蛾幼虫的体重和取食量分别显著降低了21.7%-60.7%、23.9%-76.8%。RT-qPCR分析发现，美国白蛾CarEs家族各基因和GSTs家族各基因在不同寄主植物组具有差异的表达模式，包括在高（家榆、桑）喜食性寄主植物组高表达、在中（胡桃楸、白桦）和低（紫椴、山槐）喜食性寄主植物组高表达及无固定表达的三种表达模式。HcCarE6和HcGSTs1分别是在中、低喜食性寄主植物组高表达的CarE家族基因和GST家族基因。 （2）正反向明确关键解毒基因HcCarE6和HcGSTs1介导了美国白蛾多寄主适应性的形成。通过饲喂表达HcCarE6或HcGSTs1特异性dsRNA的大肠杆菌显著降低了HcCarE6和HcGSTs1基因的表达量。HcCarE6或HcGSTs1沉默后美国白蛾幼虫对各寄主植物的适应性显著降低，表现为幼虫体重显著下降了29.8%-64.1%，且在中、低喜食性寄主植物组累计死亡率显著升高了0.78倍-40倍。同时，HcCarE6或HcGSTs1沉默导致美国白蛾三羧酸循环和糖酵解通路关键基因HcPFK、HcPK、HcIDH2和HcCS的表达量在高（水曲柳）、中（白桦）和低（紫椴）喜食性寄主植物组显著降低了28.1%-66.1%；生长调控基因HcPLK1、HcCKS1和HcCCNA的表达量在高（水曲柳）、中（白桦）喜食性寄主植物组显著降低，而在低（紫椴）喜食性寄主植物组显著提高。此外，生物测定结果表明，过表达HcCarE6、HcGSTs1的转基因果蝇品系Gal4/USA-HcCarE6和Gal4/USA-HcGSTs1对美国白蛾低喜食性寄主植物抗虫次生代谢物香豆素和金雀花碱的耐受性分别显著提高了27.50%-21.25%、13.75%-18.75%。细胞毒性测定结果表明，香豆素和金雀花碱对重组表达HcCarE6或HcGSTs1蛋白的Sf9细胞的毒性分别显著降低了19.77%-21.18%、18.52%-16.70%。 （3）利用壳聚糖和关键解毒基因dsRNA构建的核酸农药CS-dsHcGSTs1和CS-dsHcCarE6可显著降低美国白蛾对寄主植物的适应性。壳聚糖能高效负载dsHcCarE6和dsHcGSTs1，壳聚糖∶dsRNA质量比1∶3为最佳负载比例。稳定性分析表明，壳聚糖可有效保护dsHcCarE6和dsHcGSTs1免受美国白蛾幼虫肠液的降解。CS-dsHcCarE6或CS-dsHcGSTs1饲喂可显著降低美国白蛾幼虫HcCarE6和HcGSTs1基因的表达量。CS-dsHcCarE6或CS-dsHcGSTs1处理48h后，美国白蛾幼虫取食高（水曲柳）、中（白桦）、低（紫椴）喜食性寄主植物的体重显著下降了35.9%-47.8%。且更换未处理寄主植物叶片饲喂至144h后，CS-dsHcCarE6和CS-dsHcGSTs1处理组中美国白蛾幼虫体重仍未恢复至对照水平。同时， CS-dsHcCarE6 处理导致美国白蛾生长调控基因 HcPLK1、HcCKS1和HcCCNA的表达量在高（水曲柳）和中（白桦）喜食性寄主植物组显著下调，在低（紫椴）喜食性寄主植物组显著上调。而 CS-dsHcGSTs1 处理导致HcPLK1、HcCKS1的表达量在高（水曲柳）喜食性寄主组显著下调，在中（白桦）和低（紫椴）喜食性寄主植物组显著上调。生物测定结果表明，CS-dsHcCarE6或CS-dsHcGSTs1处理可显著降低美国白蛾幼虫对香豆素的耐受性，导致幼虫香豆素暴露后的死亡率分别显著增加了53.4%、40.6%。此外，CS-dsHcCarE6或CS-dsHcGSTs1与香豆素联合处理下，美国白蛾幼虫生长调控基因HcPLK1、HcCKS1、HcCCNA的表达量均显著下调，而能量代谢基因HcCS、HcIDH2和HcPFK的表达量显著上调。 综上所述，HcCarE6和HcGSTs1是介导美国白蛾多寄主适应性形成的关键解毒基因。以关键解毒基因HcCarE6和HcGSTs1为基础构建的核酸农药CS-dsHcGSTs1和CS-dsHcCarE6具有应用于绿色防控美国白蛾的重大潜力。
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