摘要
细菌、真菌和病毒等病原微生物是传染病的源头。抗感染药物的过度使用刺 激病原微生物不断突变、导致耐药细菌和变异病毒不断出现，对人类健康造成巨 大的危害。显然，传染病的源头防控迫在眉睫。 细菌可以通过抗生素耐药基因(Antibiotics resistance genes,ARGs)逃避药物 的攻击，其本质是DNA,很难降解，可在环境中持久存在。病毒的遗传物质为 核酸(DNA/RNA)，病毒核酸是主宰其致病力、耐药性及传播性的关键物质。因此， 靶向细菌耐药菌基因和病毒核酸，开发具有内在核酸分解活性的抗菌材料有望实 现从源头上控制传染病的传播。 近年来，聚离子液体(Poly ionic liquids,PILs)由于其灵活的分子可设计性和 高化学稳定性等优势，在抗菌聚合物材料领域引起关注。PILs的阳离子宫能团通 过静电作用吸附带负电荷的细菌细胞壁，随后其亲脂性烷基链插入细菌脂质膜, 导致微生物的死亡。光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)是光敏剂在特定波长 光源激发下，产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)用于杀伤靶细胞，是一种 快速杀灭微生物的重要方法。因此，将PILs与PDT整合可增强抗菌材料杀灭微 生物的性能。人工核酸酶利用多核金属配合物模拟天然核酸酶水解磷酸二酯键， 并能克服天然酶的缺点，其中铈Ce(Ⅳ)配合物因其高催化效率和良好的生物相 容性而备受关注。目前暂无将PILs、PDT和人工核酸酶协同用于杀灭微生物并 阻断细菌耐药性和病毒传播的相关报道。 本研究设计制备了咪唑型聚离子液体/卟啉/铈基电纺丝膜(PIL-P-Ce),综合评 估其作为一种阻断细菌耐药性和病毒传播的新型抗菌敷料的性能及作用机制。主 要研究内容总结如下: (1)PIL-P-Ce电纺丝膜的合成与表征。首先将咪唑基PILs与光敏剂四羧基苯 基卟啉(TCPP)的混合，通过高压电纺技术制成电纺丝膜(PIL-P),进而通过离子交 换法与Ce(Ⅳ)离子络合，得到相应的PIL-P-Ce电纺丝膜。采用核磁共振谱、FT- IR光谱、扫描电镜、透射电镜、热重分析等测试表征PIL-P-Ce电纺丝膜的化学 结构及理化性质;使用1O2指示剂检测PIL-P-Ce电纺丝膜在光照(650 nm,3.5 mW cm-2)下的光催化活性;通过溶血性和MTT细胞毒性测试分析了 PIL-P-Ce电纺 丝膜的体外生物相容性。 结果表明:纳米纤维被均匀地纺成柔软且平整的PIL-P-Ce薄膜，其化学结 构正确，电纺丝膜中的纳米纤维和元素均匀分布。此外，PIL-P-Ce电纺丝膜具有 良好的透气性、吸湿性和物理稳定性，在650 nm光照下表现出快速、高效的光 催化活性和良好的生物相容性。 (2)PIL-P-Ce电纺丝膜的DNA分解性能和机制研究。首先用BNPP测试了 PIL-P-Ce电纺丝膜对DNA的分解效率、酶动力学特性及可重复利用性能;进而 用细菌质粒和基因组DNA测试了 PIL-P-Ce电纺丝膜在生物样品中的裂解性能。 此外，研究了多种因素对PIL-P-Ce电纺丝膜分解细菌质粒DNA性能的影响，包 括温度、pH值、金属和磷酸盐离子(Na+，Mg2+，PO43-)、还原剂和螯合剂，以阐明 PIL-P-Ce电纺丝膜在650 nm光照下分解DNA的机制。最后，使用高分辨率质 谱技术比较了 PIL-P-Ce电纺丝膜和天然酶DNase Ⅰ的DNA分解性能。 结果表明:PIL-P-Ce电纺丝膜整合了 Ce4+模拟核酸酶活性和卟啉的光催化 性能，能够加速BNPP中磷酸二酯键的水解。作为一种模拟酶，PIL-P-Ce具有稳 定、可重复使用的优点。在光照下，PIL-P-Ce电纺丝膜能够快速分解细菌质粒和 基因组DNA，30min时分解率超过90％。此外，PIL-P-Ce电纺丝膜的性能非常 稳定，对温度、pH值、生理浓度的金属离子和磷酸盐的耐受性强。尽管光催化 反应具有瞬时性且会被ROS清除剂(如番茄红素)抑制，但PIL-P-Ce的固有核酸 酶活性可稳定发挥作用以弥补高浓度番茄红素对DNA分解活性的抑制。然而, EDTA的强螯合作用对PIL-P-Ce核酸酶活性的抑制是不可逆的。此外，质谱图 谱可见，PIL-P-Ce电纺丝膜在650 nm光照30 min后将细菌质粒DNA分解成 1～2 bp大小的片段，而天然DNase Ⅰ的分解产物主要是3～10 bp。这些结果进一 步证实，PIL-P-Ce整合了光催化和模拟核酸酶两种特性，能够快速高效地裂解细 菌 DNA。 (3)PIL-P-Ce电纺丝膜的体外抗菌和抗病毒性能研究。在650 nm光照30 min 条件下，测试了 PIL-P-Ce电纺丝膜对三种细菌(S.aureus,E.coli,C.albicans)和两 种病毒(HBV,HCV)的杀伤作用,以及对细菌ARGs(mecA,KanR,CDR1)和病毒核 酸(HBV-DNA，HCV-RNA)的降解活性;进而分别通过质粒转化实验和HBV感染 细胞实验，测试PIL-P-Ce电纺丝膜对细菌耐药性和病毒感染传播的阻断作用。 抗菌实验结果表明:PIL-P-Ce电纺丝膜协同了阳离子聚合物的静电和疏水 作用以及卟啉的光动力效应，具有快速、高效和广谱的抗菌效果。在杀灭细菌后， PIL-P-Ce电纺丝膜先通过静电作用吸附负电性DNA，进而协同利用光催化和模 拟核酸酶活性，快速分解微生物染色体和质粒上的ARGs。此外，细菌质粒的转 化实验进一步证实，PIL-P-Ce电纺丝膜通过高效破坏DNA,能够成功阻断细菌 耐药性传播。 抗病毒实验结果表明:PIL-P-Ce电纺丝膜兼具阳离子聚合物、光动力和模拟 核酸酶的三重效能，对DNA和RNA病毒均能有效杀灭，但与其抗菌性能相比， 需要在光照结束后延长材料与病毒的作用时间(4h)。此外，用膜材料处理的HBV 感染肝细胞以评估残余HBV的传染能力，结果证实了 PIL-P-Ce在光照下能高效 清除病毒，从而避免了肝细胞被病毒感染。 (4)PIL-P-Ce电纺丝膜对小鼠混合感染伤口的疗效评价。基于体外抗微生物、 核酸降解和生物相容性等测试，选用耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和HBV建立小 鼠皮肤伤口混合感染模型，进一步评估PIL-P-Ce电纺丝膜的体内治疗效果。在 小鼠皮肤创面上接种微生物混合液后，覆盖PIL-P和PIL-P-Ce电纺丝膜并用650 nm光照30min,外敷治疗4 h后，取下伤口敷料浸泡于PBS溶液，对敷料浸泡 液中的微生物载量和耐药基因水平进行分析。感染24 h后，对感染伤口的皮肤 组织进行微生物和炎症情况综合评估。 结果表明:PIL-P-Ce电纺丝膜能够在体内高效杀灭细菌和病毒的同时，降解 耐药基因、清除病毒核酸。此外，组织HE和免疫组织化学染色结果证实了 PIL- P-Ce电纺丝膜能够抑制感染部位的炎症。 综上所述，本研究成功研制了一种咪唑型聚离子液体/卟啉/铈基电纺丝膜， 综合评估了 PIL-P-Ce电纺丝膜整合阳离子聚合物、光催化和模拟核酸酶三重效 应，对于多种病原微生物的杀伤效果，以及对细菌ARGs(mecA,KanR,CDR1)和 病毒核酸(HBV-DNA，HCV-RNA)的降解活性。所制备的PIL-P-Ce电纺丝膜在650 nm光照下展现出高效、稳定和超广谱的微生物杀灭性能，以及对细菌ARGs和 病毒核酸的快速降解活性。小鼠皮肤伤口 MRSA和HBV混合感染的治疗试验进 一步证明，PIL-P-Ce电纺丝膜可作为一种具有内在核酸酶活性的新型抗菌敷料， 阻断临床环境中的细菌耐药性和病毒传播。
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