摘要
阴沟肠杆菌复合体(Enterobacter cloacae complex,ECC)广泛分布于自然界， 是临床常见的分离菌株。ECC的菌种分类复杂多变，2020年Wu等根据平均核 苷酸一致性(Average nucleotide identity,ANI)和 DNA 杂交值(DNA-DNA hybridization,DDH)将ECC分为22个菌种，彼此之间的遗传关系接近。ECC菌 株可携带多种耐药基因，包括质粒编码的超广谱β-内酰胺酶基因、碳青霉烯酶基 因、喹诺酮类耐药基因和多黏菌素耐药基因等。近年不断出现对碳青霉烯类耐药 阴沟肠杆菌复合体(Carbapenem-resistant Enterobacter cloacae complex,CRECC) 和多重耐药阴沟肠杆菌复合体(Multi-drug resistant Enterobacter cloacae complex, MDRECC)。 CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats- CRISPR-associated protein)系统是原核生物特有的适应性免疫系统，可防御外源 性核酸的入侵。不同细菌携带的CRISPR-Cas系统并不相同，包括cas基因、同 向重复序列(Direct Repeats,DR)和间隔序列(spacer)等。有研究报道，细菌携 带的CRISPR-Cas系统能够通过有效防御质粒的入侵，从而影响细菌对耐药基因 的获取。然而，对于ECC中CRISPR-Cas系统分布、种类与功能是怎样的，目 前尚不明了。 本研究收集2018-2020年上海某三甲医院ECC临床菌株，并与该院早年ECC 临床株(2006年和2008年)及NCBI公共数据库全基因组完整测序菌株比较， 研究其在耐药性、菌种与流行克隆的特点和变迁。此外，对ECC菌株携带的 CRISPR-Cas系统进行分析，探究ECC菌株CRISPR-Cas系统的结构特点、可识 别的原间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif,PAM)。研究内容主要分为 以下两个部分: 第一部分 某院阴沟肠杆菌复合体临床株分子流行病学特点与变迁 目的:了解上海某三甲医院ECC临床株的菌种分布、流行克隆和耐药表型特征 及变迁。 方法:收集2018-2020年上海某三甲医院224株ECC临床菌株，采用肉汤微量 稀释法和琼脂稀释法测定对抗菌药物的敏感性，基于Illumina NovaSeq测序平台 完成临床菌株的全基因组测序。下载NCBI全基因组完整测序菌株292株，与 224株临床菌株进行菌种精确鉴定，ANI值计算通过Type Strain Genome Server (https://tygs.dsmz.de/background/show)网站完成，利用 Center for Genomic Epidemiology(https://www.genomicepidemiology.org/services/)网站进行耐药基因 查找、多位点序列(MLST)分型和质粒复制子分型。该院早年(2006年与2008 年)73株ECC临床株数据来自王晨硕士论文。 结果:药敏结果显示阴沟肠杆菌复合体临床株对第三代头孢菌素、氨曲南和喹诺 酮类药物的耐药率高，范围在31.7％-46.4％之间，对美罗培南和亚胺培南的耐药 率分别为10.3％和11.2％，对阿米卡星、替加环素、美西林和磷霉素高度敏感。 在第三代头孢菌素耐药的ECC菌株里，21.9％对碳青霉烯类耐药，而该院早年耐 第三代头孢菌素分离株仅1.37％对碳青霉烯类耐药(1/73)。十年后ECC对碳青 霉烯类耐药率上升16倍。菌种鉴定结果显示该院早年与近年ECC分离株以及 NCBI数据库来源的菌株主要为香坊肠杆菌(以往分别归为Enterobacter hormaechei subsp.steigerwaltii[ENST]、E.hormaechei subsp.xiangfangensis[ENXI] 和E.hormaechei subsp.oharae[ENOH]三个亚种)和霍夫曼肠杆菌。MLST分析 显示2018-2020年ECC临床菌株共有89种不同的ST型，以ST78(E.hormaechei subsp.hoffmannii[ENHOF])为主，其次为 ST116(ENST)、ST182(ENXI),而早 年ECC临床菌株以ST93(ENST)、ST78和ST191(E.kobei)为主，较近年有 所不同，主要表现为ENST中ST型的变迁。NCBI数据库菌株共有114种ST型， 主要为ST78和ST93、ST171(ENXI)和ST108(ENOH)。224株临床菌株主要 的质粒复制子为 IncFIB(33.5％)、IncFII(28.1％)和 IncHI2(12.5％)。共有 23 株 携带碳青霉烯酶耐药基因，主要为blaNDM-1/5,其次为blaIMP-4/8,克隆传播与耐药 基因水平传播共存。90株ECC携带喹诺酮类耐药基因qnrA/B/E/S,ESBLs耐药 基因blaCTX-M、blaSHV-12和blaSFO-1的携带比率分别为10.7％、10.7％和2.7％。携 带blaNDM的菌株多带有IncX3质粒(13/16)，分布于多个菌种。NCBI数据库主 要的质粒为 IncFIB(14.9％)、IncFII(16.7％)和 IncHI2(10.2％)。137 株菌株携带 碳青霉烯酶耐药基因，ST78和ST93为主要克隆型。携带blaSHV、blaCTX-M、blaSFO 耐药基因的菌株分别有41、31、5株。78株菌株携带mcr-9耐药基因，主要由 IncHI2型质粒介导。另有112株ECC携带qnr，主要位于质粒上。而早年临床 株质粒复制子以IncHI2(65.8％,48/73)为主，多携带blaCTX-M、mcr-9、blaTEM、 blaSHV-12等耐药基因。仅1株ENXI携带blaIMP-1碳青霉烯酶基因，而近年携带 blaIMP-4/8 的 ECC 均为 ENST。 结论:近年ECC菌株对临床常用抗菌药物的耐药率较高，对碳青霉烯类药物的 耐药性较早年菌株上升16倍，多与产NDM和IMP型碳青霉烯酶相关，其菌种 及ST型分布多样，提示携带耐药基因的质粒水平转移发挥重要作用。ECC菌株 以香坊肠杆菌为优势菌种，优势耐药克隆从早年ST93转为ST78,并出现产NDM 和IMP型碳青霉烯酶的香坊肠杆菌及霍夫曼肠杆菌。IncFIB、IncFII和IncHI2 型质粒在ECC中广泛分布，携带多种耐药基因。 第二部分 阴沟肠杆菌复合体中CRISPR-Cas系统的分布及作用 目的:研究不同菌种与不同ST型ECC菌株中CRISPR-Cas系统的分布和结构特 点，探究ECC的CRISPR-Cas系统可识别的PAM序列。 方法:利用CRISPRCasFinder和CRISPRdb数据库筛查该院早年、近年及NCBI 数据库来源的ECC菌株（见第一部分）的CRISPR-Cas系统，对携带CRISPR-Cas 系统的ECC菌株构建基于SNP的系统进化树，分析菌株间的同源性。提取cas1 基因序列、DR序列和spacer序列，采用MEGA 11.0软件进行cas1基因序列的 比对和构建系统发育树;使用WebLogo和RNAfold在线网站分别对DR序列的 保守性和稳定性进行分析;借助NCBI数据库对临床菌株的spacer序列进行比对， 筛选高度同源的序列;使用BLASTn软件将spacer序列与ECC的质粒进行比对， 分析质粒携带的PAM序列。构建含CRISPR-Cas系统的重组质粒及PAM序列分 别为5''-AAC-3''、5''-GTG-3''和5''-TCC-3''的重组质粒，转化实验研究ECC的 CRISPR-Cas系统的功能及其可识别的PAM序列。 结果:在该院73株早年、224株近年ECC临床株和292株NCBI数据库及 CRISPRdb数据库的ECC菌株中，发现74株携带I-F型CRISPR-Cas系统，比 率在8.5％-13.0％之间。发现ST78和ST93型ECC均不携带CRISPR-Cas系统。 系统发育进化分析表明，ECC中cas1基因形成I、Ⅱ两簇，相同菌种及ST中的 cas1基因多聚成紧密的簇，但部分菌种或ST型含有Ⅰ、Ⅱ两种cas1基因;ECC 菌株的DR序列高度保守，可形成RNA二级结构，有利于CRISPR-Cas系统发 挥功能。携带CRISPR-Cas系统的ECC菌株，总计发现2515条spacer序列，每 个CRISPR阵列含有1-31条不等的spacer;4.4％来自临床ECC菌株的spacer序 列与质粒具有同源性，即靶向质粒。临床菌株CRISPR-Cas系统的分布与IncFIB 和IncFII型质粒呈明显的负相关关系。PAM的分析也证实ECC的spacer主要靶 向IncFIB和IncFII型质粒。PAM分析发现共有12种PAM序列，5''-TCC-3''序列 为最常见的PAM序列。发现一些IncF型质粒携带该PAM序列，转化试验显示 携带5''-TCC-3''PAM序列的重组质粒的转化效率下降近50倍，表明该序列可激 发ECC菌株CRISPR-Cas较强的免疫效应。 结论:ECC菌株主要携带I-F型CRISPR-Cas系统，ST78和ST93优势克隆型未 发现携带CRISPR-Cas系统。发现ECC中的CRISPR-Cas系统含有靶向IncFIB 和IncFII型质粒的spacer。ECC中的CRISPR-Cas系统具有免疫防御功能， 5''-TCC-3''PAM可激发ECC菌株CRISPR-Cas的免疫活性。
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