摘要
红松（Pinus koraiensis）为松科松属常绿乔木，自然分布于我国小兴安岭、长白山一带，是我国东北地区重要的经济树种和优良的用材树种。然而，红松生长周期长，常规育种方式很难实现快速的遗传改良。进行红松体细胞胚胎发生研究，一方面可以直接用于优良种质材料的大量扩繁，另一方面也为红松遗传转化研究提供有效组培体系。农杆菌介导的遗传转化是遗传改良的重要手段，本研究以稳定增殖的红松胚性愈伤组织为材料开展试验，旨在提高遗传转化效率，建立稳定高效的红松遗传转化体系，以期为红松重要基因的功能研究提供技术支撑。主要研究内容如下： （1）红松未成熟种子的消毒处理方法为：剥去种鳞和种皮的红松种子，经 75 %酒精消毒10 s、3 %次氯酸钠消毒 10 min、无菌水清洗 4-5 遍，无菌滤纸吸干种子表面的水分，用手术刀对半切开，以切口处接触培养基，接种于 DCR + 1.5 mg·L-1 NAA+ 1.0 mg·L-1 6-BA + 30 g·L-1蔗糖+ 4 g·L-1结冷胶的培养基上诱导胚性愈伤组织。结果显示，外植体污染率为3.25 %，培养 15 d 后，在胚体部位有少量半透明的胚性愈伤组织产生。 （2）红松胚性愈伤组织的最适继代增殖培养基为 DCR + 1.5 mg·L-1 NAA + 0.3 mg·L-1 6-BA + 30 g·L-1蔗糖+ 4 g·L-1结冷胶，最佳增殖继代培养周期为 10 d，可使红松胚性愈伤组织保持白色透明的增殖状态和较高的增殖效率，且愈伤组织表面的胚性胚柄细胞团（ESM）颗粒状明显，继代培养周期过长时胚性愈伤组织的颜色发黄，但对增殖效率影响较小。 （3）体细胞胚胎成熟之前，对红松胚性愈伤组织进行预培养可提高体细胞胚胎的发生量。预培养过程中培养基的种类、状态及离子浓度、预培养时间对红松胚性愈伤组织体胚发生均存在影响。红松体胚成熟的最佳预培养条件是在 1/2DCR 的继代增殖液体培养基中过渡培养14 d，可使红松胚性愈伤组织分散均匀，ESM 状态一致。 （4）在红松体细胞胚成熟的过程中，培养基中脱落酸、蔗糖与麦芽糖、结冷胶浓度对红松体胚发生量均存在影响。红松体细胞胚成熟最适培养基为 DCR + 30 mg·L-1 ABA + 40 g·L-1麦芽糖 + 8 g·L-1结冷胶，每克胚性愈伤组织的体胚发生量平均为 36.7 个。 （5）以胚性愈伤组织为试验材料，采用农杆菌介导法建立了稳定高效的红松遗传转化技术体系。结果显示，以 GV3101 菌株，侵染液浓度 OD600=0.4 侵染红松胚性愈伤组织 10 min，共培养 48 h 后脱菌，接种于继代培养基中恢复培养 10 d，移入筛选培养基对其进行连续 2 次筛选，每次筛选 21 d，共获得抗性细胞系 37 个。经 GUS 染色，阳性率为 83.78 %，随机挑选 6 块抗性组织对其进行分子检测，PCR 结果显示，均检测到了片段长度约 250 bp 的扩增产物条带，初步证明外源基因已经整合到红松基因组中。 （6）将长白落叶松 LobWRKY1 基因转入红松胚性愈伤组织对遗传转化体系进行验证，结果显示：转化的胚性愈伤组织 GUS 染色率可达 85.18%，将 GUS 检测呈阳性的组织提取 DNA 进行 PCR 检测，结果显示其均含有目的条带，证明外源基因已经整合到红松基因组中，说明该遗传转化体系高效、稳定，可用于红松转基因和分子遗传改良研究。
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