摘要
前言 阿霉素(Doxorubicin，DOX)是广泛使用于多种肿瘤治疗的蒽环类抗生素。由 于其造成的心脏毒性导致严重的左心室功能不全，最后发展成为扩张型心肌病和 心力衰竭，它在临床上的长期应用及治疗价值严重受阻。因此，开发更安全有效 的药物，在不妨碍阿霉素抗癌功效的前提下克服DOX诱导的心脏毒性成为了目前 治疗中的一个迫切需要。 磷脂酶C(PLC)是一种重要的膜相关酶。据报道，磷酸肌醇信号系统是一个复 杂的酶网络，在细胞受到刺激时对多种生物过程进行关键调控。细胞膜中的磷酸 肌醇是无数膜信号事件的主要调节因子。PLCE 1(Phospholipase C epsilon 1, 磷脂酶C epsilon 1)是磷脂酶C(PLC)家族的新成员，控制细胞内磷酸肌醇的水 平。 焦亡是一种与炎症相关的程序性细胞死亡，由Gasdermin家族蛋白质介导。通 常表现为细胞不断胀大，细胞膜破裂。最近的许多研究证实了化疗药物诱导细胞 焦亡。此外，磷酸肌醇信号系统对细胞死亡的执行有明显的影响。 然而，PLCE1与DOX诱导的心脏毒性以及细胞焦亡之间的关联尚未报道，其潜 在机制也待探讨。 本研究通过体外和体内实验，用人心肌细胞系AC16、大鼠心肌细胞系H9c2和 C57BL/6小鼠模型，评估了 PLCE1在心肌细胞焦亡中的生物学功能和分子机制。 第一部分:阿霉素诱导心肌细胞损伤中PLCE1的表达以及细胞焦亡 目的:确定PLCE1在心肌损伤模型中的表达变化，探索阿霉素心脏毒性的治疗性 新靶点;验证DOX通过焦亡的方式诱导的心肌细胞死亡。 方法:不同浓度梯度(0、0.125、0.25和0.5μM)的DOX处理AC16和H9c2心肌 细胞后检测PLCE1的蛋白以及mRNA表达变化。利用生物信息学分析对PLCE1的表 达做进一步的验证。用CCK-8法评估细胞活力，确定DOX对细胞死亡的影响;用 指定浓度的DOX处理心肌细胞，通过Western blot和RT-qPCR分别检测焦亡相关 分子 GSDME(Gasdermin E)、caspase3 和 cleaved caspase3 的表达，探讨 DOX 是否在体外研究中引起焦亡。使用siRNA特异性地在人心肌细胞系中敲低PLCE1 分子，通过Western blot和qPCR验证PLCE1的敲低效率，从测试的序列中选择 最有效的siRNA，确定PLCE1在心肌细胞焦亡中的作用。用Annexin Ⅴ-FITC和7-AAD 分析细胞凋亡率，进一步研究PLCE1是否在细胞凋亡的发生中起作用。 结果:在DOX给药的作用下，与对照组相比，AC16细胞和H9c2细胞中PLCE1 mRNA 水平和蛋白表达显著上调。生物信息学验证的结果与体外实验结果一致，PLCE1 在扩张型心肌病和心力衰竭患者中显著上调。DOX浓度升高时，AC16细胞活力明 显下降，DOX诱导心肌细胞损伤，并以剂量依赖的方式减弱了细胞活力。选择0.2 μM为后续实验中的工作浓度，在此浓度下，扩张型心肌病相关分子和PLCE1 mRNA 水平显著升高，故认为细胞模型建立成功。DOX作用后GSDME、cleaved caspase3 的表达明显升高。结果还发现，DOX处理的心肌细胞表现出典型的焦亡形态学变 化，细胞膜上出现的膜泡状气泡数量增多，LDH释放增加。心肌细胞中的PLCE1 siRNA阻碍了 GSDME蛋白的升高和caspase3蛋白的激活;RT-qPCR分析进一步证 实GSDME依赖性焦亡被siPLCE1抑制。此外，PLCE1的缺失减轻了乳酸脱氢酶(LDH) 的释放，并减弱了心肌细胞中DOX刺激后出现的膜泡状结构，敲低PLCE1有效减 弱心肌细胞发生焦亡。DOX刺激可提高凋亡细胞的百分比，然而PLCE1基因的表 达不影响细胞凋亡过程。PLCE1被抑制时，扩张型心肌病和心力衰竭相关分子的 表达明显下降，PLCE1缺失可有效降低DOX诱导的心脏毒性。 结论:PLCE1在阿霉素诱导心肌细胞损伤中高表达;DOX诱导依赖于 GSDME/caspase3信号通路的焦亡;抑制PLCE1对GSDME介导的DOX诱导的心肌细 胞焦亡有治疗作用。 第二部分:PLCE1敲低在阿霉素心脏毒性中对线粒体的保护作用以及PLCE1参 与细胞焦亡的作用机制 目的:评估线粒体功能在阿霉素诱导的心肌损伤中的作用，确认PLCE1对线粒体 功能的影响;阐明PLCE1对GSDME介导的焦亡的调控，找出PLCE1发挥作用的途 径。 方法:用DCFH-DA检测DOX处理后AC16细胞系中线粒体活性氧(ROS)水平的变化; JC-1染色检测MMP水平，利用线粒体膜电位间接评价线粒体功能;评估PLCE1表 达变化对线粒体功能的影响。测量DOX作用后心肌细胞中经典焦亡途径执行分子 GSDMD(Gasdermin D)的蛋白和mRNA变化量。通过siRNA沉默AC16细胞系的GSDME 蛋白;再通过测量MMP值，活性氧的生成量来间接评估焦亡与线粒体功能变化的 相关性。通过String数据库（https://string-db.org）查询PLCE1蛋白-蛋白相互 作用（PPIs）。进一步，在蛋白水平上验证PLCE1相关的调控机制。采用不同浓度 的P53激活剂（JNJ 26854165）预处理AC16细胞6 h后用DOX处理24 h,进行进 一步检测，探究P53通路信号对细胞焦亡的作用。 结果:DOX处理导致活性氧（ROS）生成增加，MMP显著降低，表明DOX累积产生 大量的细胞内ROS,引起线粒体膜电位破坏。然而这些变化被PLCE1的敲低所减 弱，PLCE1的缺失显著减轻了 DOX诱导的ROS的产生，逆转了 MMP的下降。 在DOX处理的心肌细胞中，GSDMD蛋白和mRNA表达水平没有变化。此结果为AC16 细胞中，化疗药物诱导GSDME介导的焦亡提供了进一步证据。GSDME沉默后，焦 亡特征性膜泡状结构数量和LDH释放减少。此外，GSDME的缺失逆转了 DOX诱导 的线粒体膜电位降低，同时减少ROS积累，减轻了 DOX诱导的线粒体损伤。从而 证实了 GSDME介导的焦亡与线粒体损伤密切相关。PPI蛋白互作结果表明PLCE1 与P53通路、PTEN分子相关联，同时与线粒体动力学有关分子紧密相连。心肌细 胞在DOX刺激后，P53的表达量增加，PLCE1敲低则显著降低P53。而在DOX作用 和PLCE1敲低后，PTEN表达水平没有明显的变化，证实了 PLCE1主要促进了 P53 通路的激活。GSDME和caspase3在心肌细胞用P53激活剂处理后明显上调，表明 P53的激活促进DOX诱导的焦亡。 结论:DOX处理导致线粒体功能障碍，PLCE1敲低在线粒体中有关键保护作用。 GSDME介导的焦亡与线粒体损伤密切相关;GSDME是DOX诱导线粒体功能障碍的决 定因素。PLCE1对焦亡的调节是由P53通路介导的。 第三部分:抑制PLCE1减弱细胞焦亡和改善心功能的体内研究 目的:构建阿霉素诱导的体内心肌损伤模型;证实GSDME介导的心肌细胞焦亡; 评估PLCE1抑制对小鼠心功能的作用。 方法:C57BL/6J小鼠随机分配进行3种处理:对照组、DOX、DOX和PLCE1抑制剂 组（每组n=8）。小鼠每周两次腹腔注射DOX（MedChemExpress,6mg/kg溶解在生 理盐水中），累积剂量为18mg/kg,持续三周。另一组接受DOX治疗的基础上， 使用U-73122抑制PLCE1。将等量生理盐水注射到对照组（第4、7、10、14、17 和21天）。为了确认PLCE1在体内的作用，小鼠在先前描述的DOX注射前每周两 次使用PLCE1抑制剂预处理，累积量12mg/kg。第一次注射DOX 4周后进行后续 分析。用2％异氟醚麻醉小鼠并进行无创超声心动图检查，评估心脏结构和功能的 变化。实验结束时取出心脏组织，分离小鼠血清样本，进行进一步分析;采用HE 染色、WGA染色、Masson三色染色检测DOX诱导的心肌组织病变。乳酸脱氢酶(LDH) 检测试剂盒用于测定小鼠血清中的LDH释放量，测定焦亡相关细胞毒性的水平。 结果:DOX应用显著增加左心室收缩末期内径(LVESD),降低左心室射血分数 (LVEF),与对照组相比，DOX作用后心肌收缩功能受损。使用PLCE1抑制剂治疗 显著降低这种效果，逆转LVESD的升高和LVEF的下降。与对照组正常的心肌形态 学相比较，DOX处理后小鼠心肌组织发生了明显的病变。而DOX+PLCE1抑制剂组 心肌结构紊乱得到改善。Western blot结果显示，注射DOX的小鼠GSDME, caspase3蛋白水平显著升高，证明DOX刺激的心脏组织中存在焦亡。同时，PLCE1 蛋白在动物模型中的表达与体外实验结果一致，假药组PLCE1蛋白表达水平较低, 而DOX处理小鼠PLCE1蛋白表达水平显著升高。PLCE1抑制也显著降低了 DOX处 理诱导的LDH释放。在DOX刺激小鼠心肌中观察到的变化在PLCE1抑制剂治疗组 成功被阻止，并几乎恢复正常。 结论:PLCE1抑制剂的应用可以缓解DOX诱导的心肌细胞焦亡;抑制PLCE1改善 心脏重构并且对心功能有保护作用。
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