摘要
目的： 组蛋白脱乙酰酶（histonedeacetylase，HDAC）是一种重要的表观遗传修饰酶，与肿瘤的发展密切相关。目前多种HDAC抑制剂（histonedeacetylaseinhibitor，HDACi）已被证实具有抗肿瘤作用。据报道，LMK235是一种选择性Ⅱa类HDAC抑制剂，可通过调节肿瘤微环境（Tumormicroenvironment，TME）对抗血液恶性肿瘤。然而，LMK235在实质肿瘤中的作用和机制仍然未知。并且LMK235与传统化疗药物紫杉醇（Paclitaxel，PTX）的联合治疗对肿瘤微环境的影响以及是否可以提高治疗效果也尚未探知的。 方法： 1.体外研究LMK235单独用药对肿瘤细胞的作用。 （1）用CCK-8法检测不同浓度的LMK235对RM-1、B16-F10的细胞毒性。 （2）用划痕实验检测不同浓度的LMK235对RM-1、B16-F10迁移能力的抑制效果。 （3）用克隆形成实验检测不同浓度的LMK235对RM-1、B16-F10克隆形成的抑制效果。 （4）用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，检测不同浓度的LMK235对RM-1、B16-F10肿瘤细胞凋亡发生的诱导效果。 2.LMK235联合Paclitaxel对肿瘤细胞的作用及机制。 （1）用CCK-8法检测探究Paclitaxel对RM-1、B16-F10的细胞毒性。 （2）用CCK-8法探究LMK235联合Paclitaxel对RM-1、B16-F10的细胞毒性。 （3）利用ZIP相互作用效能模型，选取最合适的联合药物使用剂量； （4）在最佳药物联合剂量下，探究LMK235联合Paclitaxel对RM-1、B16-F10的迁移能力、克隆形成能力、凋亡的影响。 3.探究LMK235联合Paclitaxel在小鼠体内对肿瘤的作用。 （1）选用5-6周龄的C57BL/6小鼠，构建小鼠皮下肿瘤模型，小鼠随机分为四组：对照组，LMK235单用药组、Paclitaxel单用药组、LMK235和Paclitaxel联合治疗组。探究LMK235与Paclitaxel联合使用在肿瘤中的作用。 （2）使用Hamp;E染色和免疫组化实验，评估瘤组织坏死区域和肿瘤组织中免疫细胞群及标志物的变化，探究LMK235联合Paclitaxel对肿瘤微环境的影响。 结果： 1.实时荧光定量PCR结果显示，RM-1、B16-F10与BMM相比，HDAC基因表达升高。 2.CCK-8的结果显示，1μM、2μM和4μM剂量的LMK235对RM-1存在浓度梯度性抑制,125nM,250nM,500nM剂量的LMK235对B16-F10无存在浓度梯度性抑制；10nM、20nM和40nM剂量的Paclitaxel对RM-1、B16-F10存在浓度梯度性抑制。 3.细胞划痕实验结果显示，在相同培养状态下，与对照组相比，LMK235组、Paclitaxel组、LMK235+Paclitaxel组中，RM-1、B16-F10的迁移能力下调。 4.细胞克隆形成实验结果显示，与对照组相比，LMK235组、Paclitaxel组、LMK235+Paclitaxel组中，RM-1、B16-F10肿瘤细胞克隆形成能力下调。 5.细胞流式凋亡实验结果显示，与对照组相比，LMK235组、Paclitaxel组存在凋亡上调；与单用药组相比，LMK235+Paclitaxel联合治疗组中，RM-1、B16-F10凋亡上调更显著。 6.小鼠在体实验结果显示，与对照组相比，LMK235组、Paclitaxel组存在治疗效果；与单用药组相比，LMK235+Paclitaxel治疗组对RM-1、B16-F10有更显著的治疗效果。 7.小鼠免疫组化实验结果显示，LMK235+Paclitaxel治疗组提高肿瘤微环境中M1型巨噬细胞表达。 结论： （1）LMK235和Paclitaxel单独治疗，在体外实验中均证明可抑制多种肿瘤细胞的增殖、迁移，诱导肿瘤细胞凋亡上调，这种作用具有浓度依赖性和时间依赖性。 （2）LMK235和Paclitaxel联合用药可以更有效地抑制细胞的增殖、迁移、诱导肿瘤细胞凋亡上调，两种药物具有协同治疗效果。 （3）LMK235和Paclitaxel联合用药可以改变肿瘤微环境中多种重要标志物表达情况，并可通过介导巨噬细胞极化调节肿瘤微环境，抑制肿瘤的发生发展。
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