摘要
急性痛风性炎症主要是由于沉积在组织中的单钠尿酸盐(Monosodiumurate,MSU)晶体刺激的先天免疫反应所引起的，MSU晶体激活巨噬细胞转化为促炎状态，并使炎症小体复合物的受体蛋白之一NOD样受体家族中热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-likereceptorthermalproteindomainassociatedprotein3,NLRP3)炎症小体被激活，释放白细胞介素(Interleukin，IL)-1β和肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等多种促炎细胞因子，进一步促进中性粒细胞募集引发炎症反应。 巨噬细胞通过促炎(M1型)和抑炎(M2型)的表型转化，改变其生理功能，而响应各种微环境的刺激。多年前的研究就发现，巨噬细胞向M1/M2表型极化在痛风的炎症和自发缓解中扮演着重要的角色。我们课题组之前的研究结果显示，MSU晶体诱导的炎症缓解很可能是巨噬细胞向M2表型极化的加强。这些研究提示了巨噬细胞极化在痛风免疫应答中发挥不可忽视的作用。 Mer酪氨酸激酶(Mertyrosinekinases，MerTK)作为TAM(Tyro3、Axl和MerTK)家族的受体酪氨酸激酶(Receptortyrosinekinases,RTK)成员，表达在所有组织的吞噬细胞(如巨噬细胞、树突状细胞等)的表面。已有诸多研究发现MerTK在急性炎症过程中的抗炎作用，最近的研究发现，MerTK在调节外周巨噬细胞的炎症反应中起着关键作用。包括IL-4、IL-10和地塞米松等M2极化诱导剂，均能诱导MerTK蛋白的表达。尽管已知MerTK能促进肿瘤中巨噬细胞从M1向M2表型的转变，MerTK也可以通过调控炎症因子的分泌来发挥免疫抑制的作用，我们之前研究发现，抑制MerTK表达可以逆转IL-37改善MSU晶体诱导的痛风炎症的缓解作用。然而，MerTK是否可以通过促进M2巨噬细胞的活化来响应MSU晶体刺激而缓解痛风炎症至今不清楚，如果答案是肯定的。那么，MerTK又是通过什么途径或机制实现对痛风炎症缓解呢？ 为此本课题将围绕MerTK受体酪氨酸激酶展开如下研究:首先明确其是否参与痛风的炎症缓解过程，其次探索其参与痛风炎症缓解的机制，尤其是如何通过影响巨噬细胞先天免疫反应，如炎症因子产生、极化方向转变及线粒体功能变化等方面进行研究，并探讨可能涉及的通路，进一步阐明MerTK与配体的相互作用如何实现，最终结合最新生物学材料的应用进行临床转化，试图从基础延伸到临床转化应用，尝试提供新的治疗靶点。 第一部分MerTK参与痛风炎症的缓解过程 目的:探讨酪氨酸蛋白激酶MerTK是否参与痛风炎症，以及探索其可能的作用。 方法:采用免疫组化、ELISA、RT-qPCR等检测痛风患者滑膜或外周血MerTK的表达。以MSU诱导的痛风小鼠模型，分析MerTK抑制剂(UNC2250)对炎症和巨噬细胞极化的影响。通过RT-qPCR、WesternBlot和流式细胞术检测THP-1来源的巨噬细胞在抑制、敲低或过表达MerTK后的炎症反应和极化水平。评估UNC2250对THP-1来源巨噬细胞的线粒体功能调控作用。 结果:与健康对照组相比，痛风患者滑膜和外周血中MerTK表达均明显升高。与MSU组相比，MSU+iMer组小鼠足掌关节的炎症反应进一步加剧，表现为足掌肿胀指数增加以及炎症细胞浸润增加，且RT-qPCR和WesternBlot结果显示MSU+iMer组小鼠表现出显著的炎症和M1极化反应。免疫荧光共定位染色结果显示在抑制MerTK后，F4/80+iNOS+标记的M1型巨噬细胞增加，而F4/80+CD206+标记的M2型巨噬细胞减少。在急性痛风腹腔炎症模型中在MSU+iMer组中可以观察到IL-1β表达水平显著升高，以及M1/M2极化(iNOS/Arg-1)比例显著升高。在MSU诱导THP-1细胞炎症模型中，使用UNC2250抑制MerTK、通过siRNA敲低MerTK或过表达MerTK干预细胞后，均能影响炎症反应和极化转变。抑制MerTK导致THP-1来源的巨噬细胞的ROS水平升高和线粒体膜电位降低。 结论:酪氨酸蛋白激酶MerTK参与了痛风炎症过程，可能是通过调节巨噬细胞向M2极化以及维持线粒体功能来缓解炎症。 第二部分MerTK影响MSU诱导的THP-1巨噬细胞中的免疫反应是通过PI3K/Akt/GSK-3β途径 目的:明确MerTK影响MSU刺激的THP-1来源巨噬细胞免疫反应是依赖于PI3K/Akt/GSK-3β通路。 方法:使用人c55通路磷酸化蛋白芯片检测抑制MerTK后下游通路磷酸化蛋白的激活情况，并用RT-qPCR和WesternBlot进行验证。敲低/过表达MerTK观察对MSU刺激的巨噬细胞下游通路磷酸化的影响。特异性抑制PI3K/Akt,检测THP-1细胞中MerTK的表达水平以及评估巨噬细胞吞噬MSU功能。 结果:人c55通路磷酸化蛋白芯片结果显示，UNC2250处理抑制MerTK后，MSU诱导THP-1细胞的Akt(S473)和GSK-3β(S9)磷酸化水平明显降低，WesternBlot进一步验证了这个结果。敲低、过表达MerTK,对Akt(S473)和GSK-3β(S9)磷酸化的激活能力有显著的影响。特异性抑制PI3K/Akt后，THP-1细胞中MerTK的表达水平降低，且加重了UNC2250本身引起的MSU刺激的THP-1细胞吞噬抑制，使得吞噬功能进一步抑制。 结论:MerTK影响MSU诱导的THP-1巨噬细胞免疫反应，是通过PI3K/Akt/GSK-3β途径实现的。 第三部分生长停滞特异性6(Growtharrest-specificprotein6，Gas6)-MerTK信号传导的激活调控巨噬细胞极化缓解痛风炎症 目的:探索Gas6缓解MSU介导的痛风炎症反应是通过活化MerTK信号来发挥作用。 方法:采用免疫组化、ELISA、RT-qPCR检测痛风患者滑膜组织或外周血Gas6的表达情况，多重免疫荧光检测痛风组织中MerTK和Gas6的共定位表达。在敲低、过表达或予外源性Gas6干预后，通过RT-qPCR、WesternBlot和流式细胞术评估THP-1细胞的炎症及极化等先天免疫反应变化，免疫荧光观察MSU刺激的THP-1细胞MerTK和Gas6的共定位情况。敲低MerTK,予外源性Gas6干预后WB检测MerTK、IL-1β和iNOS蛋白表达。 结果:与健康对照组相比，痛风患者滑膜和外周血中Gas6表达均明显升高。分别通过加入外源性Gas6、过表达Gas6和siRNA干扰Gas6,发现对MSU刺激的THP-1细胞中免疫反应产生显著影响，表现为炎症因子的调节，巨噬细胞极化方向的转变。予外源性的Gas6处理，MSU刺激的THP-1细胞线粒体的ROS产生减少。人滑膜组织行多重免疫荧光结果显示MerTK和Gas6共定位表达增加，进一步在体外THP-1中行细胞免疫荧光也能看到两者在细胞表面共定位增加。外源性Gas6的处理导致MSU刺激的THP-1巨噬细胞促炎因子降低，iNOS蛋白表达减少，抑制巨噬细胞向M1极化，而敲减MerTK则抑制了这些作用。 结论:这部分结果证明了Gas6参与痛风炎症的过程，且抗炎效应是通过与受体MerTK结合来发挥作用的，因此Gas6-MerTK信号传导的激活可以缓解MSU介导的痛风炎症反应。 第四部分CMCS@SA负载Gas6发挥pH响应抗炎作用来缓解痛风 目的:探究CMCS@SA负载Gas6是否能够发挥pH响应抗炎作用来缓解痛风。 方法:利用气流控设备，构建了负载Gas6的pH响应型水凝胶微球并观察其物理表征，用CCK-8和活/死染色试剂检测生物相容性，以及检测其促凋亡作用。在体外实验中，用ELISA、RT-qPCR和WB检测炎症因子表达，用流式细胞术、RT-qPCR和WB检测巨噬细胞极化状态变化。在体内实验中，用H&E染色评估足掌炎症浸润程度，多重免疫荧光染色共定位巨噬细胞及极化标记物，用RT-qPCR及WB检测炎症因子及极化标记物的基因表达和蛋白水平，分离各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器做H&E染色来评估该药物的生物安全性。 结果:成功构建负载Gas6的pH响应型水凝胶微球，并证明其有良好的物理表征和生物相容性，对巨噬细胞有较好的抑凋亡作用。在体外实验中，CMCS@SAG可以显著提高对MSU的非炎性吞噬作用，且流式细胞术和多重免疫荧光显示M1/M2标记物比值明显降低，ELISA和RT-qPCR检测促炎因子明显减少，抑炎因子明显增加。在体内模型中，CMCS@SAG组足掌关节肿胀程度降低、炎症浸润情况减轻、多重免疫荧光显示巨噬细胞明显向M2方向极化，CMCS@SAG组表现出显著的抑炎和促M2极化效应。 结论:这部分结果证明了Gas6的pH响应型水凝胶微球能够实现调节巨噬细胞极化促进痛风炎症缓解的效应，能够用于改善炎症微环境，延缓痛风的进展。 总结 本研究首先证明了酪氨酸蛋白激酶MerTK参与痛风，并通过体内外实验证明其下调炎症相关细胞因子表达，调节巨噬细胞向M2极化状态以及维持线粒体功能稳态从而缓解痛风炎症，并证明该作用是通过PI3K/Akt/GSK-3β通路实现;同时证明了MerTK是通过与其配体Gas6结合来参与痛风缓解的过程，并构建了CMCS@SA包裹Gas6的水凝胶微球发挥pH响应抗炎作用来缓解痛风。
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