摘要
七烯甲萘醌(MK-7)是脂溶性维生素K2的一种十分重要的亚型，它具有预防骨质疏松、预防血管钙化、降低血管损伤等生理功能，在功能性食品和医药等领域中备受关注，具有广阔的应用前景。目前MK-7主要利用枯草芽孢杆菌为底盘细胞合成，MK-7作为疏水性化合物，主要储存在细胞膜上，这限制了其储存空间，是进一步提升MK-7合成水平的瓶颈问题。解脂耶氏酵母可以提供充足的乙酰辅酶A和MVA途径用于合成MK-7的聚异戊二烯侧链，并对疏水性化合物具有良好的转运和储存能力，作为合成MK-7的底盘细胞具有极大优势。为了验证利用解脂耶氏酵母合成MK-7的可行性，本研究旨在构建一株能通过外源添加前体异源合成MK-7的解脂耶氏酵母底盘细胞，并通过代谢工程改造、过氧化物酶体工程和发酵工艺优化提高MK-7产量，为利用解脂耶氏酵母的从头合成MK-7奠定基础，为MK-7的工业化生产提供新的思路。 首先，本论文以Yarrowialipolytica为底盘细胞，通过将经过密码子优化枯草芽孢杆菌来源的menA、hepS、hepT、menG构建基因表达框，组装到PINA1312质粒中，再通过酶切成线性片段转化入解脂耶氏酵母中，构建了YQ-3、YQ-6菌株，通过外源添加DHNA(1,4-二羟基-2-萘甲酸)合成MK-7；通过相同方法，引入外源menA、hepS、hepT基因表达框，构建了YQ-2、YQ-4、YQ-5菌株，通过外源添加VK3(维生素K3)合成MK-7。我们对外源前体DHNA和VK3的添加时间和最佳催化时间进行了优化，结果表明，YQ-5、YQ-6在最佳催化条件下，MK-7最大产量分别为0.49mg/L、0.53mg/L。 其次，为了进一步了解MK-7合成酶在酵母中异源表达情况，我们将MenA，MenG两个膜蛋白与GFP蛋白进行融合表达，通过荧光显微镜观察其细胞定位。结果表明，MenA表达在液泡中，MenG表达在细胞质中。接着我们对MVA途径关键基因HMG1、IDI和ERG20进行了过表达，过表达HMG1，IDI和ERG20得到菌株YQ-7，产量达到1.57mg/L，相比较YQ-6提高了3.06倍。过表达了HMG1，IDI和ERG20(F87W)得到YQ-8，产量达到2.2mg/L，相比较YQ-6提高了1.4倍。最后，我们将MenA，MenG，HepS/T，ERG20(F87W)通过信号肽定位在过氧化物酶体中，并过表达了HMG1，IDI，得到YQ-9，产量达到2.84mg/L，是YQ-6的5.68倍和YQ-8的1.29倍。 最后，对改造的菌株YQ-9的碳源种类、碳源比例、氮源种类、发酵时间等条件进行优化，得到最佳培养条件：最优碳源为大豆油；最佳的碳源比例为大豆油：葡萄糖为9∶1；最佳氮源为豆粕粉；最佳发酵时间为120h；Mg2+浓度为20mmol/L；吐温80为5%；BHT含量为0.05%；初始pH为自然，温度为31℃，转速为210rpm。最终在最佳发酵条件下，摇瓶中产量达到了278mg/L。 通过上述研究，我们验证了在解脂耶氏酵母中合成MK-7的可行性，成功构建了解脂耶氏酵母工程菌株，达到了目前报道的在酵母中合成MK-7的最高产量，为酵母从头合成MK-7奠定了基础。
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