摘要
由柑橘黄单胞柑橘亚种（Xanthomonascitrisubsp.citri，Xcc）引起的柑橘溃疡病是柑橘生产上的一种毁灭性细菌病害，严重影响我国柑橘产业健康发展。植物内生菌因其良好的适应性和定殖能力在植物病害的生物防治方面具有巨大优势和广泛的应用前景。本研究通过筛选有抗菌活性的植物内生菌并评估其对多种植物病原菌的生防潜力，探究其对柑橘溃疡病菌的抑菌机制，鉴定主要抑菌活性物质，并从代谢层面研究生防菌与抗菌能力相关的关键代谢物及代谢途径。以期为柑橘溃疡病的生物防治挖掘更多优质菌种资源，为抗菌机制研究和抗菌物质筛选提供新的理论依据和参考。 1、拮抗菌的筛选、鉴定。本研究以柑橘溃疡病菌（Xcc）、野生稻鞘腐病原菌（Sarocladiumoryzae）等10种植物病原菌为目标病原菌，采用平板对峙法筛选出1株具有高效广谱抑菌活性的内生细菌。经菌落形态特征、生理生化特征以及16SrDNA、gyrB、rpoB多基因序列分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌，命名为BacillusamyloliquefaciensZJLMBA1908。 2、拮抗菌生物防治效果及抗菌机理初步研究。该菌株无菌发酵液对尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubense4，Foc4）、新暗色柱节孢（Neoscytalidiumdimidiatum）、稻黑孢（Nigrosporaoryzae）、茄腐镰孢菌（F.solani）、帚梗霉（S.oryzae）、斯氏泛菌产吲哚亚种（Pantoeastewartiisubsp.indologenes，Psi）及Xcc等7种植物病原菌均具有不同程度的抑菌活性。病原细菌中，对Xcc抑菌率最高，为27.71%；病原真菌中对N.oryzae抑菌率最高，为63.75%。无菌发酵液中的活性物质具有耐高温、强酸强碱及蛋白酶降解特性，长时间暴露于紫外光下仍具有良好的抗菌稳定性。利用特异性引物扩增，发现菌株ZJLMBA1908存在参与Iturin、Surfactin和Bacillaene等多种脂肽类和聚酮类抑菌化合物的基因簇。在鉴定培养基上检测到菌株具备生产蛋白酶、纤维素酶的能力。 3、拮抗粗提物的分离纯化、鉴定及抗菌防病作用。无菌发酵液中分离提取的拮抗粗提物对病原细菌Xcc和Psi的最小抑菌浓度分别为11.55和46.19μg/mL，对Xcc的最小杀菌浓度为184.75μg/mL。室内盆栽试验结果表明使用拮抗粗提物对柑橘溃疡病进行防控能够显著降低柑橘溃疡病的严重程度和发病率，其防病效率可达67.11%。无菌发酵液粗提物经高效液相色谱（HPLC）初步纯化后得到一种组分CE3，抑菌实验表明CE3可完全抑制Xcc的生长。经液相色谱-质谱联用（LC-ESI-MS）分析鉴定，CE3主要成分为棕榈酸、表面活性素C15、植物鞘氨醇和二氢鞘氨醇。 4、拮抗菌株代谢组学抗菌机制研究。为了探究拮抗菌抗菌机制以及造成对数期（EP）、平台期（SP）和衰亡期（DP）的拮抗菌抗菌能力差异的原因，实验选取培养了12h，24h和60h拮抗菌的无菌发酵液进行代谢组学分析。经次生代谢产物多元统计分析筛选出差异化合物共103个，其中关键代谢物N-乙酰基-β-丙氨酸（Acetyl-beta-alanine）对Xcc最高抑菌率为40.24%。差异代谢路径主要富集于莽草酸代谢途径。利用250μM的莽草酸脱氢酶抑制剂姜黄素可显著降低拮抗菌的抗菌活性，使其抗菌活性降低4.73%，同时使得莽草酸代谢路径中关键物质基因aroE、aroK、aroA、aroC、aroH、pheA的表达量分别下调2.76、0.84、1.55、0.68、2.39、2.06倍。进一步利用LC-ESI-MS对经姜黄素处理后代谢物进行定量分析，发现差异代谢物主要富集在苯丙氨酸代谢和苯丙烷类化合物生物合成。说明苯丙氨酸和苯丙烷类化合物是造成不同阶段拮抗菌抗菌活性差异的主要因素。 综上所述，植物内生菌B.amyloliquefaciensZJLMBA1908及其次生代谢物有良好的环境适应性和广谱抗病性，具有广阔的应用前景。代谢组学研究结果为研究内生菌的抗菌机制和抗菌物质筛选提供了新的理论依据和参考。
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