摘要
猪嵴病毒(PorcineKobuvirus,PKV)是小RNA病毒科嵴病毒属成员，是近年在腹泻猪体内发现的新型病毒。同属成员还有爱知病毒(Aichivirus,AiV)和牛嵴病毒(Bovinekobuvirus,BKV),目前，爱知病毒和牛嵴病毒都已成功分离，而猪嵴病毒尚没有成功分离的报道。 近年来我国大部分地区规模化猪场暴发仔猪腹泻，导致仔猪大量死亡，造成严重的经济损失。研究人员推测这可能与新发现的小RNA病毒如猪嵴病毒等有关。有研究表明，猪嵴病毒在在腹泻猪和健康猪群内广泛存在，猪群感染率非常高，而且有研究表明猪嵴病毒感染很可能与猪腹泻有关。获得纯化的病毒是研究其致病性及其理化特征的基础，由于猪嵴病毒尚不能成功分离，本研究采用反向遗传操作技术，在获得病毒全基因组序列的基础上，人工构建出囊括PKV全基因组的全长cDNA感染性克隆，通过转染特定细胞系，人工拯救出完整的PKV病毒。 为便于在蛋白水平上检测PKV,我们表达PKV-DX株的VP3结构蛋白，免疫Balb/c小鼠，通过常规杂交瘤技术获得一株能够稳定分泌抗VP3结构蛋白的杂交瘤细胞，为下游PKV拯救病毒的鉴定及深入研究奠定了基础。 通过分析本实验室测得的PKV-DX株全基因组序列及pBeloBAC11载体、CMV启动子、HDV-BGH终止元件的序列，选择合适的酶切位点将PKV全基因组进行分段，同时设计引物引入无意突变分子标签。使用高保真酶从病料中扩增出囊括PKV基因组的各片段，依次插入含有CMV启动子、HDV-BGH终止元件的pBeloBAC11载体，构建出PKV全长质粒命名为pBAC-PKV-DX。全长质粒转染293T细胞，72h后通过RT-PCR、IFA、WB和电镜等技术对拯救病毒进行验证。结果表明，PKV成功实现了人工拯救。 在全基因组序列比对中发现PKV2B区在不同基因组中存在缺失现象，而DX株为基因缺失株。为探究2B区域缺失对病毒拯救的影响，在原有质粒pBAC-PKV-DX的基础上，人工合成PKVXM株2B区域不缺失的部分，构建不缺失的重组质粒pBAC-PKV-2B，转染293T细胞，72h后进行鉴定。结果表明，2B区域缺失与否对病毒拯救没有影响。 本研究构建了两个囊括PKV-DX株全基因组的全长质粒，在此基础上实现了对PKV的人工拯救。建立了PKV基因组的操作平台，为PKV的后续研究打下基础。
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