摘要
朱砂叶螨Tetranychuscinnabarinus是世界性的重要农业害螨，被列为世界五大害虫/螨之一，以化学防治为主。由于杀螨剂的大规模、不科学使用导致朱砂叶螨对多种杀螨剂产生了高水平抗性，其抗药性问题变得不可忽视。丁氟螨酯是一种新型酰基乙腈类的非内吸性杀螨剂，被普遍用以防除田间害螨。大量研究表明，造成昆虫（螨）对多种杀虫（螨）剂产生代谢抗性的主要原因是解毒代谢酶基因的过表达。尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UDP-糖基转移酶，UGTs）是昆虫（螨）代谢抗性形成中重要的Ⅱ相解毒代谢酶，但UGTs与朱砂叶螨代谢抗性形成的关系及其转录调控机制尚不清楚，缺乏深入研究。因此，本研究基于实验室朱砂叶螨转录组数据，以朱砂叶螨为研究对象，对UDP-糖基转移酶与朱砂叶螨丁氟螨酯抗药性的相关关系进行研究，并初步探究UGT基因表达的转录调控机制。主要研究结果如下： 1、利用药膜法对朱砂叶螨云南丁氟螨酯抗性（YN-CyR）品系和云南敏感（YN-S）品系进行毒力测定。结果显示，YN-CyR和YN-S品系的LC50分别为26.84mg/L和0.53mg/L，抗性倍数为50.64倍。使用UGTs专性抑制剂5-硝基尿嘧啶处理后，结果显示YN-CyR和YN-S品系的LC50分别下降为13.06mg/L和0.39mg/L，增效比分别为2.05和1.36，抗性倍数下降为33.49倍，表明5-硝基尿嘧啶对YN-CyR和YN-S品系均具有显著增效作用，且在抗性品系中的增效作用更明显。UGTs酶活性测定结果显示，YN-CyR品系的UGTs酶活性是YN-S品系的7.89倍；使用5-硝基尿嘧啶处理后，YN-CyR和YN-S品系的UGTs酶活性被显著抑制，酶活性分别下降了9.51倍和1.66倍。以上结果初步表明UGTs酶活性升高在朱砂叶螨丁氟螨酯抗性形成中发挥了重要作用。 2、基于实验室朱砂叶螨转录组数据，共鉴定出23条在低、中、高三个抗性阶段均上调表达的UGT基因。在YN-CyR和YN-S品系中，将23条基因的表达量对数比值从高到低排序，选择上调倍数排前12位的UGT基因进行qPCR验证。最终8条UGT基因的qPCR验证结果为（4条UGT基因因其引物设计不理想而放弃比较），在YN-CyR品系中UGT202A12、UGT201H1、UGT204A1、UGT204A2及UGT202A16为上调表达，UGT201C1、UGT204B1及UGT202A1的表达量差异性不显著。同时，在室内丁氟螨酯抗性（CyR）品系中UGT202A12、UGT201H1、UGT204A1及UGT204A2为上调表达，UGT201C1、UGT204B1、UGT202A16及UGT202A1表达量变化无明显差异。其中，UGT201H1的上调倍数在YN-CyR品系中达到YN-S品系的102倍，在CyR品系中达到SS品系的37倍，表明UGT201H1的过表达在朱砂叶螨丁氟螨酯抗性形成中可能具有重要作用。 3、对朱砂叶螨UGT201H1基因进行全长克隆，该基因cDNA开放阅读框为1329bp，编码442个氨基酸。生物信息学分析表明，UGT201H1编码蛋白质的相对分子量和理论等电点分别为51.40kDa和6.27，该蛋白不存在跨膜结构域和信号肽，为细胞质酶。叶碟饲喂RNAi法抑制朱砂叶螨UGT201H1表达后，通过药膜法测定其对丁氟螨酯敏感性变化。结果显示，在YN-CyR品系中UGT201H1沉默效率为56.61%，YN-CyR品系的LC50由处理前的27.41mg/L显著降低至9.40mg/L；在YN-S品系中其沉默效率为63.57%，YN-S品系的LC50由0.61mg/L下降至0.41mg/L，抗性倍数从45.14倍降低至23.05倍，表明UGT201H1在朱砂叶螨丁氟螨酯抗性形成中发挥了重要作用。 4、构建了pET-28a-UGT201H1、pET-32a-UGT201H1、pET-30a-UGT201H1、pCold-GST-UGT201H1和pCold-SUMO-UGT201H15种原核表达载体，IPTG诱导表达结果显示UGT201H1均以包涵体形式表达。采用包涵体复性技术对pET-28a-UGT201H1包涵体进行复性并成功获得了UGT201H1的可溶重组蛋白。酶学性质测定结果显示，重组UGT201H1蛋白的Km和Vmax值分别为51.60±11.98μM和15.69±3.07μmol/mgpro.min-1。丁氟螨酯对重组UGT201H1蛋白的抑制中浓度IC50为69.77±7.93μM，抑制常数Ki值为18.73±3.48μM。体外代谢试验表明重组UGT201H1蛋白能够代谢丁氟螨酯，50μg/mL和100μg/mL该蛋白的代谢率分别为64.73±6.60%和86.67±2.40%，但其对AB-1（丁氟螨酯代谢活性物质）无代谢作用。以上结果表明重组UGT201H1蛋白可能通过糖苷化作用代谢丁氟螨酯从而介导了朱砂叶螨对丁氟螨酯的代谢抗性。 5、通过克隆获得朱砂叶螨UGT201H1启动子序列，并利用生物学网站对转录因子CncC、HR96及AhR在UGT201H1启动子序列的潜在结合位点进行预测。结果显示三种转录因子在其启动子处均存在结合位点。利用荧光素酶报告基因系统进一步探究CncC、TcHR96h及AhR对UGT201H1启动子的调控作用。结果显示，共转染AhR和UGT201H1启动子的荧光活性高于AhR单独转染对照组，活性变化倍数为1.65倍；CncC和TcHR96h则对UGT201H1启动子的荧光活性没有增强作用。以上结果表明转录因子AhR可能调控了UGT201H1基因的过表达。 综上所述，UGT201H1参与朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗药性，转录因子AhR可能调控了UGT201H1的过表达。本论文的研究成果进一步解释了UGT基因在昆虫（螨）代谢抗性形成中的作用及其表达的转录调控机制，为该领域提供新的思路。
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