摘要
水稻是我国重要粮食作物，提高水稻产量是保障我国粮食安全重要的一部分。杂交水稻的推广与应用大幅提高了水稻产量。雄性不育材料是杂交水稻育种的关键，近年来“第三代智能不育育种技术”将此前无法被应用的不受环境影响的雄性核不育材料通过基因工程技术进行了有效利用，解决了雄性核不育材料大规模繁殖的难题，生产出不含转基因成分的杂交水稻种子。由此可见，对雄性核不育基因的挖掘与功能研究不仅能丰富水稻基因功能研究成果，具备理论研究价值，更能够被利用于杂交水稻育种中进一步提高水稻产量，具备应用生产价值。 本研究从籼稻“西大1B”甲基磺酸乙酯诱变突变体库中发现鉴定了一个稳定雄性不育突变体osuge1，通过对其进行表型鉴定、图位克隆和功能分析，确定了osuge1花粉败育的发育机制，完成了目的基因的克隆并对目的基因的表达模式与酶活功能进行了初步探究，主要研究结果如下： 1osuge1的表型观察 相较于野生型，osuge1突变体表现为生殖生长阶段不能结实，osuge1花药干瘪皱缩，不能产生花粉。扫描电镜观察发现osuge1花药外壁蜡质层网状结构缺失，花药内壁乌氏体缺失，花粉粒干瘪破碎。半薄切片发现osuge1绒毡层并未如野生型一样在第8b期开始降解，而是逐渐膨大，并空泡化，在第12期完全空泡，第13期绒毡层消失。透射电镜发现osuge1绒毡层细胞在第8b-11期都未出现明显的降解，细胞核等细胞器持续可见，osuge1第10期绒毡层表面乌氏体缺失，花粉外壁缺失柱状层。TUNEL染色表明osuge1绒毡层在第8b-10期并未出现明显的凋亡信号，第12期有少量凋亡信号出现。osuge1花药胼胝质信号在第8b期较野生型更暗，花药中果胶含量较野生型更少，阿拉伯半乳糖蛋白（Arabinogalactanproteins,AGPs）较野生型有更多累积，半纤维含量无明显差异。osuge1表现为花药绒毡层降解延迟与花粉壁缺陷并最终导致完全雄性不育。 2osuge1的图位克隆 遗传分析表明osuge1受1对隐性核基因控制，精细定位将osuge1定位于第5染色体323kb物理距离内。基因组重测序分析发现在一个UDP-葡萄糖/半乳糖差向异构酶（UDP-glucose/galactoseepimerase,UGE）编码基因LOC_Os05g51670的第5外显子-内含子的边界处的mRNA剪切识别位点“AG”发生了单个碱基的替换，突变为“UG”，导致第6外显子部分序列被错误剪切，造成237号氨基酸后移码并在8个氨基酸后翻译提前终止。通过向osuge1突变体中转入ProOsUGE1:OsUGE1互补载体获得OsUGE1-COM互补植株，其育性得到恢复。通过CRISPR/Cas9对OsUGE1进行基因敲除，得到了osuge1-cas9突变体，其表现出与osuge1突变体相同的雄性不育表型。综合以上实验结果将LOC_Os05g51670确定为OsUGE1的目的基因。OsUGE1在数据库中预测含有3种可变剪切，产生3个不同大小的转录本，通过转录组分析与差异片段扩增，发现在小穗中实际仅存在1个转录本。 3OsUGE1的酶活功能 OsUGE1编码一个UDP-葡萄糖/半乳糖差向异构酶，可以催化UDP-葡萄糖（UDP-Glc）与UDP-半乳糖（UDP-Gal）的相互转化。在仅有UDP-Glc或UDP-Gal的反应体系中分别加入OsUGE1与osuge1突变蛋白进行反应，通过测定反应后UDP-Glc和UDP-Gal的含量变化，发现OsUGE1具备催化UDP-Glc和UDP-Gal相互转化的活性，而osuge1突变蛋白丢失该催化活性。通过对野生型和osuge1突变体小穗中UDP-Glc和UDP-Gal的含量进行检测，发现与野生型相比，osuge1突变体中UDP-Glc含量降低，UDP-Gal含量升高。 4OsUGE1的表达模式 通过提取野生型不同时期与组织的RNA反转录成为cDNA进行RT-qPCR，发现OsUGE1在各个时期的根部都有较高的转录水平表达，在生殖生长阶段的穗部也有较高的表达，具体高表达在花药发育第7-8b期。GUS报告基因染色结果表明OsUGE1在根部、花药与花粉中有较高表达水平。mRNA原位杂交发现OsUGE1在第8a期的绒毡层与小孢子中表达，利用OsUGE1自身抗体进行染色发现OsUGE1蛋白出现在第8a-9期的绒毡层与小孢子中。 5OsUGE1转录组分析与验证 通过对osuge1突变体花药发育第3-9期小穗进行转录组测序并进行富集分析，共发现4377个基因转录水平与野生型存在差异，其中上调基因2166个，下调基因2211个。对差异基因进行类聚分析，GO富集结果发现在几丁质酶活性、分子功能抑制活性、果胶代谢途径、细胞壁分解代谢途径和细胞壁形成相关集群中差异基因有较高程度的富集。KEGG富集结果发现丙烷代谢途径、戊糖代谢途径、黄酮类合成途径和氨基酸与核苷酸糖代谢途径差异基因存在显著富集。通过RT-qPCR分析OsUGE1相关基因在野生型与osuge1突变体第7-10期花药中的转录水平差异，发现水稻4个UGE中OsUGE1的表达水平明显降低，OsUGE3的表达水平有少量上升；OsGAMYB与EAT1的表达水平在第9期有明显降低，OsABCG26在第7期有少量上升，而TDR、UDT1等绒毡层发育相关基因无明显变化。
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