摘要
柑橘是一类具有重要经济价值的木本果树，但通过传统的育种手段改良柑橘非常困难。柑橘转基因技术的不断完善极大缩短了育种周期。柑橘转基因体系由模式植物转基因体系发展而来，然而，目前绝大部分的研究使用的上胚轴根癌农杆菌转化体系存在嵌合体，转化率低，再生芽成活率低等问题。胚性愈伤组织由于具有易转化，可进行体细胞胚胎发生等特性，是遗传转化、体细胞融合和诱变育种等研究的良好材料。利用愈伤组织系开展相关研究的基础是愈伤组织能稳定继代和再生，而大部分柑橘愈伤组织经过多次继代，增殖能力和再生能力会随着时间逐渐减弱或消失，普遍发生染色体变异现象。愈伤组织再生成植株效率很低，一些次生代谢产物在愈伤组织中不合成或合成量很低等原因限制了愈伤组织在柑橘功能基因研究方面的应用。因此建立稳定的愈伤组织培养和高效分化的技术体系，对拓展愈伤组织转化体系的应用范围，提高功能基因的研究效率等具有重要意义。 本研究对锦橙和瓦伦西亚两种不同基因型的甜橙品种的不同时期的幼嫩胚珠进行诱导培养，筛选出最适的愈伤组织诱导条件和采样时间。对诱导获得的愈伤组织和胚状体分别进行继代培养，确定愈伤组织稳定继代体系的最佳驯化方案，并获得稳定继代的胚性愈伤组织系。通过改变不同培养因素诱导愈伤组织分化，评估不同继代次数愈伤组织的分化能力，建立稳定诱导愈伤组织产生分化的最佳方案。对愈伤组织和胚状体中的次生代谢产物，类黄酮的含量进行了检测，确定两种组织中类黄酮含量是否有明显差异。对愈伤组织和再生的胚状体进行化学和物理条件处理，根据类黄酮合成相关基因的表达，筛选诱导基因表达的最适处理条件。对愈伤组织的遗传转化能力进行了评价。综合以上研究内容，建立一套能稳定诱导、继代和再分化的柑橘胚性愈伤组织培养技术，可批量提供稳定的愈伤组织用以遗传转化，进行相关功能基因的研究，主要研究结果如下： 1）愈伤组织稳定继代培养：花后4-5周的幼嫩胚珠在MT培养基(MT+40g/L蔗糖+3.2g/L植物凝胶)，26℃黑暗条件下培养，愈伤组织诱导率最高。诱导产生的愈伤组织和胚状体的最佳驯化方案是用TB(MT+40g/L蔗糖+10mg/L6-BA)和MT两种培养基进行交替培养；胚状体也可用MAg(MT+40g/L蔗糖+2mg/LAgNO3)和MT两种培养基交替培养。稳定继代后，愈伤组织的增殖培养基为CPM(MT+40g/L蔗糖+0.4mg/LTDZ)。 2)愈伤组织稳定分化培养：最佳培养方案是22℃黑暗条件下在GY培养基(MT+40g/L蔗糖+20g/L甘油)上培养，随着继代次数增加，分化诱导率未发生显著改变，但愈伤组织的分化程度下降，在继代至第9代时，愈伤组织仍有100%的胚状体发生率。渗透胁迫处理和激素处理对愈伤组织的分化诱导无影响。 3)类黄酮含量和基因表达量的组织差异：在绿色胚状体中类黄酮含量显著高于愈伤组织中类黄酮的含量。类黄酮合成相关的5个基因表达量，在锦橙中绿色胚状体均显著高于愈伤组织，在瓦伦西亚甜橙中则只有2个基因。因此，愈伤组织分化成绿色球形胚就可以验证某些次生代谢产物基因的功能。 4）遗传转化：对锦橙和瓦伦西亚甜橙的愈伤组织进行根癌农杆菌介导的遗传转化实验，得到锦橙转基因绿色荧光愈伤组织，表明目前培养的愈伤组织能被转化。
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