摘要
星状病毒（Astrovirus，AstV）是一种能引起哺乳类动物腹泻的单股正链RNA病毒。该病毒具有复杂的遗传多样性，易发生基因重组、跨物种传播，严重威胁动物和人类健康。本实验室于2022年首次报道小熊猫星状病毒，此病毒在圈养小熊猫种群中的流行病学研究工作亟须开展。本文基于已经完成全基因组序列测定的两株病毒开展了序列分析、TaqMan双重实时荧光定量PCR建立和临床检测等工作。 研究方法如下：（1）根据本实验室测序完成并上传到Genbank上的两个基因型小熊猫星状病毒RpAstV-1（RedPandaastrovirus1）和RpAstV-2（RedPandaastrovirus2）的全序列进行序列分析；（2）利用生物信息学软件对两株小熊猫星状病毒衣壳蛋白的二级结构和优势B细胞表位进行预测；（3）根据两株小熊猫星状病毒的高保守序列设计了两对特异性引物和探针，通过优化反应体系，进行特异性试验、敏感性试验和重复性试验，最终建立了一种TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法；（4）利用建立的TaqMan双重荧光定量PCR检测方法对来自成都大熊猫繁育研究基地的803份样品进行检测。 研究结果如下：（1）基于ORF2（Openreadingframe2）的全核苷酸序列建立的遗传进化树表明，两株小熊猫星状病毒之间遗传距离较远，属于两个不同的进化分支；（2）通过计算ORF2蛋白平均氨基酸遗传距离可知，新发现的RpAstV-1与猫4型星状病毒和貉3型星状病毒可划分为相同的种，RpAstV-2与猪2型星状病毒可划分为相同的种；（3）根据重组软件结果推测，RpAstV-1与貉3型星状病毒SD-F3株和猫4型星状病毒FAstV-D1株之间存在重组的现象；（4）结合病毒衣壳蛋白的二级结构和生物信息学软件预测结果，两株病毒各筛选出3条亲水性高、柔度大、抗原性强、表面可及性大的优势B细胞抗原表位；（5）成功建立了一种针对小熊猫星状病毒的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法，20μL反应体系中，两对引物最佳浓度均为300nM，探针最佳浓度均为200nM，最佳退火温度为58.2℃。RpAstV-1可检测的极限浓度为102copies/μL的标准质粒，RpAstV-2可检测的极限浓度为101copies/μL的标准质粒，与其他病毒核酸均无非特异性反应；（6）临床样本检测结果表明，小熊猫星状病毒在小熊猫种群中整体阳性率为5.85%（47/803）。 综上所述，本研究首次对小熊猫星状病毒进行了序列分析，为进一步了解小熊猫星状病毒的分子生物学特性及防控奠定了科学基础。建立的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法可用于小熊猫组织样品和粪便样品的检测，为临床检测提供了技术支撑。
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