摘要
蓝舌病（Bluetongue,BT）是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒（BTV）引起的可感染山羊、绵羊、牛、鹿和骆驼等反刍动物的传染病。该病可经媒介昆虫（如库蠓、伊蚊等）传播，病畜以口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发生溃疡性炎症变化为特征。BTV血清型众多，目前已至少存在26个血清型。由于BT各个血清学之间没有交叉保护作用，因此，尽早鉴别诊断爆发的BT血清型并在该病流行区域接种相应的疫苗是防治本病的关键。 BTV基因组由10个双股正链RNA组成，10个节段基因编码7种结构蛋白（VP1～VP7）和4种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3、NS3a）。其中VP2蛋白和VP5蛋白是BT的血清型特异性抗原。根据Genbank中BTV1L2基因序列（登录号:JN848760.1）和M5基因序列（登录号:JN848763.1）各设计1对引物，从感染BTV1的BHK-21细胞沉淀中提取病毒RNA,经RT-PCR扩增L2基因和M5基因。将这两段基因酶切后分别克隆至pMAL-c4x原核表达载体和pFastBacHTA真核表达载体，分别表达重组的VP2蛋白和VP5蛋白。 分别以原核系统表达的VP2蛋白和VP5蛋白免疫4-6周龄的BALB/c小鼠，第3次免疫后测效价，加强免疫后将鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。以真核表达系统表达的重组蛋白为检测抗原，通过间接ELISA方法筛选出4株能稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体（Monoclonalantibody,Mab）的杂交瘤细胞，分别命名为BTV1VP2-3E8、BTV1VP2-3A7、BTV1VP2-4E2和BTV1VP2-4B6,简称为3E8、3A7、4E2和4B6;筛选出4株能稳定分泌抗VP5蛋白Mab的杂交瘤细胞，分别命名为BTV1VP5-1B9、BTV1VP5-1F3、BTV1VP5-3B6、BTV1VP5-4E10,简称为1B9、1F3、3B6和4E10。 Westernblot结果表明4株针对BTV1-VP2Mabs和4株针对BTV1-VP5Mabs都可与BTV1在BHK-21细胞中表达的相应蛋白反应，而与对照BHK-21细胞碎片不反应;IFA结果表明3E8、4E2、4B6、1B9都与BTV1发生特异性反应，与其他血清型呈阴性反应，为建立BTV1鉴别诊断方法奠定了基础。此外，3A7、1F3、3B6、4E10与BTV1反应外，这4株单抗还有各自的反应谱系，如3A7还与BTV8反应，1F3还与BTV2、BTV9、BTV18、BTV23反应，3B6还与BTV2、BTV9反应，4E10还与BTV2,BTV18,BTV23反应。利用肽扫描和合成肽的方法，对这几株Mabs所识别的抗原表位进行了鉴定，结果表明，Mab3E8识别的抗原表位为465YGQMINEMI473;Mab4B6识别的抗原表位为115AQPLKVGL122;Mab3A7识别的抗原表位为149SYHVEPIE156;Mab1F3识别的抗原表位为141EIEDEKQFDILNKAVT156;Mab1B9识别的抗原表位为121EKFGKELEEVYNFMNG136;Mab3B6识别的抗原表位为281SVVSTILEYRAKEIPD296;4E10识别的抗原表位为161ILTEEDLQMRRLATAL176。 本研究制备的Mabs及所鉴定的抗原表位，为BTV1型特异性检测方法的建立及BTV1VP2、VP5蛋白功能研究提供了基础，对BT的防控具有重要意义。
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