摘要
疯草主要指含苦马豆素（Swainsonine,SW）的棘豆属（OxytropisDC.）和黄芪属（AstragalusL.）有毒植物，对于草原畜牧业危害巨大。小花棘豆（OxytropisglabraDC.）是内蒙古草原主要的疯草物种，牲畜食用一段时间疯草后会出现中毒症状，如肌肉震颤、呕吐、母畜流产、公畜不育及死亡。经研究发现，小花棘豆的毒性来源并非植物本身，而是由其内生真菌Alternariaoxytropis产生的SW引起。 swnH2基因是SW合成相关基因簇成员，编码α-酮戊二酸和铁(Ⅱ)依赖性加氧酶。课题组前期构建了Alternaria.oxytropisOW7.8的swnH2基因敲除载体，本研究将swnH2基因敲除载体转化A.oxytropisOW7.8原生质体，构建和筛选出swnH2基因敲除突变株ΔswnH2，利用HPLC-MS检测其菌丝体SW水平，分析swnH2基因功能对SW合成的影响；对OW7.8与ΔswnH2进行高通量有参转录组测序及代谢组检测分析，主要研究结果如下： （1）将swnH2基因敲除载体通过PEG介导转化A.oxytropisOW7.8原生质体，利用同源重组敲除swnH2基因，在含Hyg（2μg/ml）的PDA培养基中筛选转化子，利用PCR和测序技术进行验证，筛选出基因敲除株ΔswnH2，与野生株相比，ΔswnH2菌落形态有所不同，生长初期为乳白色，形状不规则，呈松散颗粒状，正面背面均无色素积累，生长速度缓慢，生长后期菌落呈淡黄色，形状呈片层状堆叠；ΔswnH2菌丝体变短，指端膨大、隆起，部分菌丝体表面向内凹陷，整体结构致密。 （2）利用乙酸-氯仿溶液提取生长20d的A.oxytropisOW7.8和ΔswnH2菌丝体的SW，SW进入水相后，以阳离子交换树脂进行纯化、氨水进行洗脱，利用HPLC-MS技术检测菌丝体中SW水平，ΔswnH2中未测到SW，A.oxytropisOW7.8中的SW水平为111.83±61.940μg/g，说明swnH2基因功能促进SW的合成。 （3）利用IlluminaNovaSeq6000高通量测序平台对生长20d的A.oxytropisOW7.8和ΔswnH2进行转录组测序分析，共有2489个差异表达基因，其中1186个上调、1303个下调，进行了GO和KEGG功能富集分析；利用高分辨质谱（HRMS）技术对生长20d的A.oxytropisOW7.8和ΔswnH2进行代谢组检测，PCA分析、代谢物注释及分类，共有607个差异代谢物，其中398个上调、209个下调，利用KEGG和HMDB数据库对代谢产物进行富集分析，综合转录组和代谢组数据，推测和细化了A.oxytropisOW7.8中SW合成途径。 （4）利用RT-qPCR技术检测ΔswnH2和A.oxytropisOW7.8菌株中SW合成相关基因表达，结果显示sac、swnR、swnN、swnK、swnH1基因表达均下调，P5CR基因表达变化不显著。 （5）将swnH2cDNA与载体pBARGPE1-mCherry连接，构建出swnH2基因功能互补载体，含gPDA启动子、Trpc终止子，选择标记基因分别为Bar（真菌）、AmpR（E.coli）。 基于以上结果，推测A.oxytropisOW7.8内生真菌中与SW合成密切关联基因及SW合成途径，为明晰A.oxytropis中SW合成的分子机制与代谢途径提供基础数据，对于预防牲畜疯草病和疯草的控制利用有重要意义。
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