摘要
淡竹叶（LophatherumgracileBrongn.）是我国传统中药，在历版《中国药典》中均有记载，具有悠久的药用历史，富含黄酮、多糖、氨基酸等多种成分，其中黄酮类化合物是其主要活性成分，具有抗菌、抗氧化、保肝、抗病毒、心肌保护等多种药理作用，但关于淡竹叶黄酮抗炎活性的研究尚不充分。因此，本论文以淡竹叶为研究对象，首次采用匀浆辅助超声法提取淡竹叶黄酮，并通过单因素、Plackett-Burman（PB）和Box-Behnken（BBD）响应面等试验进行了提取工艺优化；其次，利用AB-8型大孔树脂对粗提液中的黄酮进行纯化富集，得到富含淡竹叶黄酮的提取物（DHT）；然后采用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）对DHT进行分析，最后，分别通过化学法和LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型评价其抗氧化和抗炎活性。具体研究结果如下： 1.DHT的提取与纯化。采用匀浆辅助超声法，以提取液中的黄酮含量为指标，在单因素试验的基础上，通过PB试验筛选关键因素，并借助BBD响应面法进一步优化淡竹叶中黄酮的提取工艺，最终确定最佳的提取工艺为：匀浆功率700W、匀浆超声时间15min、超声功率400W、乙醇浓度70%、料液比1∶20，并根据最佳工艺条件进行3次验证试验，最后黄酮实际含量为28.41±0.57mg/g，与预测值基本相符。淡竹叶黄酮粗提液经AB-8型大孔树脂进一步纯化富集后，得到纯度为61.19%的DHT。 2.DHT成分分析及体外抗氧化活性评价。采用UPLC-MS/MS对DHT进行检测，结果初步鉴定出11种黄酮类化合物，包括木犀草素6-C-β-D-六碳糖醛酸基（1→2）-β-D-葡萄糖苷、异荭草苷、日当药黄素、荭草苷、牡荆素、异牡荆素、芹菜素6-C-β-D-半乳糖醛酸基（1→2）-α-L-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O葡萄糖苷、当药黄素、鸡豆黄素配糖物、苜蓿素-7-O-葡萄糖苷。并通过HPLC对DHT中的异荭草苷、日当药黄素、荭草苷、牡荆素、异牡荆素这5种碳苷黄酮进行定量分析，结果显示DHT中含有异荭草苷74.79±0.55mg/g、日当药黄素169.75±1.04mg/g、荭草苷1.96±0.09mg/g、牡荆素11.16±0.32mg/g和异牡荆素7.58±0.27mg/g，总含量为265.25±2.27mg/g，占总黄酮比例的43.55±0.38%。采用傅里叶红外光谱对DHT进行结构表征，并采用DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除法评价其抗氧化活性。红外结果表明，DHT含有O-H伸缩振动（3390cm-1）、C-H键伸缩振动（2927cm-1）、C=O双键伸缩振动（1649cm-1）、苯环骨架伸缩振动（1581cm-1）和C-O伸缩振动（1267cm-1）等黄酮特征吸收峰。抗氧化结果表明，DHT清除ABTS自由基、DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的IC50值分别为0.148mg/mL、0.423mg/mL、1.021mg/mL、0.349mg/mL，抗氧化能力较强。 3.DHT的抗炎活性评价。构建RAW264.7细胞炎症模型，经DHT处理后对培养基上清液中的炎症介质、炎症细胞因子及细胞内氧化应激指标进行检测，同时评估RAW264.7炎症模型细胞的凋亡情况。1）炎症介质及炎症细胞因子检测结果显示，与LPS模型组相比，中、高剂量（50、100μg/mL）的DHT显著抑制了经LPS诱导的RAW264.7炎症模型细胞中炎症介质的释放，例如一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2），以及促炎细胞因子的产生（P＜0.05），如白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。同时，DHT还显著上调了抗炎细胞因子白细胞介素-10（IL-10）的水平（P＜0.05），且高剂量DHT的效果与Dex（50μg/mL）相当。这表明淡竹叶黄酮能有效抑制促炎细胞因子的表达，提升抗炎细胞因子水平以及抑制炎症介质的产生来发挥抗炎作用。2）细胞内氧化应激指标检测结果显示，与LPS模型组相比，DHT显著增强了谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性（P＜0.05），同时显著降低了丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量（P＜0.05）。这一结果表明DHT能够有效减轻LPS诱导的炎症模型细胞的氧化应激损伤，对炎症模型细胞具有一定的保护作用。3）细胞凋亡结果显示，LPS模型组的细胞凋亡率为56.70%，与空白组（6.97%）相比增加了49.73%，而低中高剂量DHT(10、50、100μg/mL)处理组的细胞凋亡率分别为48.65%、38.23%、27.94%。与LPS处理组相比，DHT处理组的细胞凋亡率分别下降了8.05%、18.47%、28.76%，显著降低了RAW264.7炎症模型细胞的凋亡率，且呈现剂量依赖性，说明DHT对LPS诱导的RAW264.7炎症模型细胞具有一定的保护作用。
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