摘要
背景：根据国家人口统计局各项研究数据表明，2022年中国人口首次出现负增长，有1.86亿人患有不孕症。这其中，男性精子数量和质量也在断崖式下降。由温度升高引起的男性生殖力下降表现为弱精、少精，严重可致无精子症。热暴露导致相关生精细胞例如精母细胞的损伤死亡，其背后具体的作用机制并不清楚。 目的：本研究通过动物和细胞热暴露模型的构建，借助基因表达谱测序，筛选验证与热暴露后导致精子发生障碍有关的基因。通过细胞功能学实验验证该基因与精子发生存在的联系，为日常生活中睾丸热暴露的温度作重要参考依据。 方法：通过设计不同温度及温度处理后不同处死时间的实验小鼠构建睾丸热暴露模型。随后对模型小鼠的睾丸和附睾组织进行Hamp;E染色、血清激素检测、生殖相关参数的统计以及分析已有的基因表达谱测序，通过验证筛选与铁死亡有关的转录活化因子-3（Activatingtranscriptionfactor3,ATF-3），实验证明ATF3在睾丸热暴露后引发的精子发生障碍中起重要作用。后续建立小鼠精母细胞系（Spermatocyte,GC-2）热暴露模型，检测温度升高与GC-2增殖变化的关系，在该模型中探究ATF3与热暴露导致精子发生障碍之间的联系。 结果：1.热暴露模型鼠出现睾丸形态异常，激素水平的异常和成熟精子数量减少。热暴露组随着处理温度升高，睾丸体积明显缩小。43℃组内部的曲细精管管腔出现萎缩，生殖细胞排列松散，大量的生殖细胞发生凋亡和脱落，而且处理后28天仍存在明显异常。而37℃与40℃处理后的结果显示温度升高后睾丸内部的基底层细胞排列紊乱，附睾中成熟精子数量减少且异常精子比例增加。但是在处理后21天，这两个处理组均表现明显的修复趋势。这表明睾丸热暴露后确实产生一定的损伤，表现为精子发生障碍，但是损伤的程度和修复程度与处理时的温度有关系。 2.对已有热暴露模型的睾丸组织进行基因表达谱测序分析，通过对差异表达基因的验证，筛选出ATF3在睾丸热暴露后导致精子发生障碍的过程中起到重要的作用。在热暴露组的睾丸中，ATF3表达上调后结合在细胞核内，导致细胞膜上溶质载体家族7成员11(Solutecarrierfamily7member11Gene,SLC7A11)表达受到阻碍，抑制了细胞内外的氨基酸运转，最终导致谷胱甘肽过氧化酶4（Glutathioneperoxidase4,GPX4）功能的下降。GPX4功能的部分缺失会引发铁死亡效应，表现为细胞死亡。 3.对热暴露处理后的小鼠进行合笼实验，实验组较对照组产仔数没有明显区别，但每一窝中雄鼠数量明显高于雌鼠数量，这可能与血清中的糖皮质激素表达升高有关。随后提取小鼠精子中的RNA，检测雌性分化相关基因：类固醇生成因子-1（Nuclearreceptorsubfamily5groupAmember1,Nr5a1）和细胞色素P450家族19亚家族A成员1（CytochromeP450family19subfamilyAmember1,Cyp19a1），结果表明实验组中这两对基因的表达量更低。对子一代雌雄鼠进行体重监测，发现实验组雌鼠在40天内体重比对照组轻，而雄鼠体重减轻的情况持续的时间更长，在80天才恢复正常。通过检测30天、50天和80天雌雄鼠的生殖力相关参数进一步证明亲代睾丸热暴露导致子一代发育暂缓。 4.为探讨ATF3与生殖细胞的联系，构建GC-2热暴露细胞模型。在GC-2细胞热暴露模型中，随着温度升高，细胞增殖能力下降，在处理后6小时细胞ATF3的表达升高，导致SLC7A11表达下降，出现GPX4对细胞内外的氨基酸调控能力的减弱，活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）堆积并出现铁死亡。最终在处理后24小时，细胞增殖能力开始恢复到正常水平。实验证实热暴露后GC-2细胞增殖能力下降，ATF3表达增加并触发铁死亡，并且在处理后24小时细胞发生损伤的自我修复。 结论：通过构建体内外热暴露模型，表明温度升高后ATF3表达增加，触发氧化应激效应和铁死亡通路导致机体精子发生障碍，并导致子一代发育暂缓，从分子生物学角度解释热暴露对精子发生障碍的深层次原因。
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