摘要
随着中国老龄化时代的到来，癌症的发病率与死亡率正逐年增加并且肺癌的发病率与死亡率在中国已居于首位，其中非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)发病率占总肺癌的85%左右。NSCLC患者的治疗手段主要包括放疗、化疗、手术与靶向治疗等，但在NSCLC治疗过程中出现的耐药、术后复发，远处转移等问题急需新的解决方案。在抗肿瘤药物研发方面，活性天然产物扮演着重要的角色。常山酮（Halofuginone，HF）为中药常山提取物常山乙素（Febrifugine，FF）的衍生物，近年来对常山酮的深入研究发现其具有良好的抗肿瘤活性，拥有较大的临床应用潜力，但其对NSCLC的抗肿瘤作用及机制依然不明。 目的： 本研究旨在初步探究常山酮对NSCLC的抑制作用及其机制，为常山酮的临床应用及其作为先导化合物研发新的抗肿瘤药物提供理论依据。 方法： 首先，通过CCK-8法、EdU增殖实验、克隆形成实验、侵袭实验、迁移实验检测常山酮对肺腺癌细胞HCC827和H1975增殖能力、侵袭能力、迁移能力的影响。通过网络药理学探究常山酮对NSCLC的可能作用靶点，并进行富集分析，探究常山酮影响的生物过程。CYTO-ID检测细胞自噬情况；通过流式细胞术检测常山酮作用后细胞周期分布、凋亡情况，westernblot检测相关蛋白的表达水平。TMRE法检测线粒体膜电位变化，DCFH-DA探针法检测常山酮诱导ROS生成情况。在BALB/c裸鼠中建立HCC827皮下瘤动物模型，通过瘤体积增长速度情况，评估常山酮抗肿瘤效果并在瘤组织上通过组织染色方法验证常山酮抗肿瘤途径。 结果： 1.常山酮抑制NSCLC细胞增殖、侵袭和迁移 对HCC827与H1975细胞进行细胞增殖检测，结果证明常山酮在较低浓度便可抑制细胞增殖与存活。对HCC827与H1975细胞进行侵袭与迁移实验，证明常山酮显著抑制肺癌细胞侵袭与迁移能力。 2．网络药理学探讨常山酮对NSCLC抑制作用的机制 采用网络药理学的方法，发现常山酮可能的作用靶点并进行富集分析。KEGG富集发现常山酮对NSCLC抑制作用与凋亡、自噬、细胞周期等相关。GO富集分析表明常山酮对NSCLC抑制作用可能与诱导ROS产生相关。 3.常山酮改变细胞周期分布 对常山酮作用后的细胞进行周期检测，我们发现常山酮可以改变NSCLC细胞周期分布，将细胞阻滞于S期；westernblot实验证明了常山酮引起CDK2、p-CDK2表达水平降低，造成细胞周期阻滞。 4．常山酮诱导细胞自噬发生 电镜观察细胞亚显微结构发现常山酮处理组细胞出现自噬小体,自噬流监测观察到随着常山酮剂量的增加，细胞自噬水平增加；westernblot实验证明常山酮作用后自噬相关蛋白LC3-Ⅱ水平升高，P62水平下降。 5．常山酮诱导细胞凋亡 通过对常山酮作用后的细胞进行凋亡检测，我们发现常山酮可以剂量依赖性增加细胞凋亡率。westernblot实验证明随着常山酮浓度增加Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3等表达水平增加。 6．常山酮诱导HCC827与H1975细胞发生ROS依赖的凋亡和自噬 在常山酮作用24h后便可引起HCC827与H1975细胞线粒体膜电位改变，使线粒体膜电位降低。常山酮诱导6h便造成细胞内ROS水平增加。联合抗氧化剂NAC时，可以明显改善常山酮对细胞的增殖抑制。在NAC与常山酮联用时，可以降低常山酮诱导的凋亡和自噬水平。 7．常山酮抑制HCC827裸鼠皮下瘤的生长 通过HCC827裸鼠皮下瘤实验，结果证明常山酮具有显著的抑制肿瘤生长的作用。通过对肝肾功能部分指标的检测、内脏HE切片观察，证明常山酮在腹腔注射（0.15mg/kg）的剂量下便有较好的抗肿瘤效果并且对小鼠内脏无明显损伤。 结论： 常山酮在体内外对NSCLC均有较好的抑制效果；常山酮对NSCLC的抑制作用与其诱导肿瘤细胞ROS升高，诱导细胞凋亡，自噬，造成细胞周期阻滞相关。
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