高毒力大丽轮枝菌特异基因组区段的筛选与毒力功能初步鉴定

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中文摘要：大丽轮枝菌是一种土传性的植物病原真菌，可引起棉花黄萎病，严重影响棉花的产量和品质,给棉花生产带来了巨大的损失。鉴于黄萎病的土传特性，且其在无寄主存在情况下，可以以微菌核的形式在土壤中存活10年之久，化学防治、生物防治和常规抗病育种等多种策略的效果不理想。因此，探究大丽轮枝菌的致病分子机理，已经成为防治黄萎病的重要前提。利用新一代高通量测序技术Solaxa对高毒力菌株VDG1和低毒力菌株VDG2进行了全基因组测序，结果显示VDG1基因组组装大小为32.47Mb,VDG2基因组组装大小为34.19Mb。在此基础上，通过两菌株基因组比较分析和PCR实验确证了高毒力菌株VDG1存在11个特异基因组区段(SCF4、SCF12、SCF23、SCF43、SCF73、SCF272、SCF525、SCF571、SCF822、SCF823和SCF882),长度分别为88.5kb、101.8kb、31.7kb、13.4kb、27.1kb、56.1kb、9.7kb、3.3kb、11.4kb、1.8kb和61.5kb。11个特异基因组区段共编码69个基因，其中有8个为潜在分泌蛋白基因;有6个注释为碳水化合物水解酶(Carbohydrate-ActiveenZYmesDatabase,CAZy);有14个基因和病原菌-寄主互作相关基因(PathogenHostInteractionDatabase,PHI)同源。在编码的69个特异基因中，有7个基因与大丽轮枝菌多糖代谢相关，7个基因编码蛋白激酶，3个基因和转录调控相关，6个基因参与大丽轮枝菌体内氧化还原代谢反应，其它部分基因则可能参与大丽轮枝菌物质转运、基团转移、脂类代谢等。此外，还有22个基因功能未知。利用已报道致病型(落叶和非落叶)分子标记对来自不同棉区不同毒力的80株大丽轮枝菌(病情指数20.5±1.3-84.3±8.9)进行PCR检测发现，致病型分子标记可以将80株大丽轮枝菌划分为落叶群D(Defoliating,D)与非落叶群ND(Non-Defoliating,ND)。落叶群D共有62株大丽轮枝菌，菌株病情指数为24.8±9.2-84.3±8.9,平均54.7±1.9;非落叶群ND共有17株大丽轮枝菌，菌株病情指数为20.5±1.3-40.8±3.4,平均32.4±1.5;此外，有1株大丽轮枝菌VDG72未检测到致病型分子标记。t检验分析发现落叶群D中菌株的平均病情指数显著地高于非落叶群ND中菌株的平均病情指数(P＜0.01)。以80株大丽轮枝菌为研究对象，随机挑选41个VDG1特异基因和65个VDG2特异基因检测特异基因组区段与大丽轮枝菌毒力的关系。结果表明，特异基因组区段可以将80株大丽轮枝菌分为致病力高低的两个群:VDG1-Like群体，含有VDG1特有的基因组区段但缺失VDG2特异基因组区段，共有61株大丽轮枝菌，菌株病情指数为24.9±4.6-84.3±8.9,平均55.4±1.9;VDG2-Like群体，含有VDG2多数特有的基因组区段但缺失VDG1特异基因组区段，共有19株大丽轮枝菌，菌株病情指数为20.5±1.3-64.8±5.4,平均36.4±2.8。统计分析表明，VDG1-Like亚群中菌株的毒力显著高于VDG2-Like亚群中菌株的毒力(P＜0.01),大丽轮枝菌的特异基因组区段和毒力存在相关性。进一步分析发现，特异基因组区段对80株大丽轮枝菌的划分结果与D和ND分子标记的划分结果高度相似，即VDG1-Like中有58株菌属于落叶型，占95.1％;VDG2-Like中有15菌株属于非落叶型，占78.9％;表明特异基因组区段和大丽轮枝菌致病力以及致病型密切相关。因此，大丽轮枝菌特异基因组区段的类型是决定其致病型或者致病力的重要因素之一。为明确特异基因组区段同大丽轮枝菌致病力之间的关系，本研究构建了11个含有致死基因(HSVtk,编码单纯疱疹病毒胸苷激酶用于反向筛选)的VDG1特异基因组区段敲除质粒，并通过农杆菌介导法转化大丽轮枝菌，经过后续的抗性(潮霉素和5-氟-2''-脱氧-尿苷)筛选，单孢分离纯化和PCR扩增实验鉴定，共获得8个VDG1特异基因组区段敲除突变体，分别是△SCF4、△SCF12、△SCF43、△SCF73、△SCF272、△SCF525、△SCF822和△SCF823,每个突变体各有3株。采用定量蘸根接种方法对8个VDG1特异基因组区段突变体进行了致病力鉴定，所获得的8个特异基因组区段突变体中，△SCF272的三个突变体△SCF272-6-1、△SCF272-6-2和△SCF272-6-3对军棉1号的致病力均显著下降;△SCF4、△SCF73、△SCF822和△SCF823的二个突变体中，均有一个突变体（△SCF4-7、△SCF73-4、△SCF822-10和△SCF823-6）的病情指数显著的低于野生型对照菌株VDG1;△SCF12、△SCF43和△SCF525二个突变体与野生型VDG1相比致病力均无显著变化。结果表明，VDG1特异基因组区段（特别是SCF272）和大丽轮枝菌的致病力显著相关。因此,进一步筛选和鉴定特异基因组区段的致病相关基因对解析大丽轮枝菌致病分子机理具有重要意义。

作者：

王金龙

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关键词：

棉花黄萎病大丽轮枝菌致病分子机理特异基因组区段毒力鉴定

授予学位：

硕士

学科专业：

作物遗传育种

导师：

戴小枫

学位年度：

2020

学位授予单位：

中国农业科学院

语种：

中文

中图分类号：