摘要
杨梅（MyricarubraSieb.amp;Zucc.）为原产于中国的特色果树，其果实色泽鲜艳、风味独特，具有很高的营养价值和经济价值。然而成熟的杨梅鲜果质地柔软、不耐储运，制约了产业发展，因此研究杨梅果实质地变化规律，明确其生理和分子机制，有利于从采收前减缓果实软化进程，实现对杨梅果肉质地的合理调控。本研究以‘水晶’、‘东魁’、‘早佳’为试验材料，对果实各项生理指标进行分析，探究杨梅果实质地差异的构成因素，筛选在杨梅果实软化进程中的关键酶。运用生物信息学方法结合转录组数据，筛选得到果实软化差异基因MrBGAL10和MrBGAL11。通过分子生物学、瞬时遗传转化等方法初步验证MrBGAL10和MrBGAL11在调控果肉质地方面的功能。结果如下： （1）杨梅果实软化进程中质地差异构成因素及关键酶的筛选。选取杨梅果实发育三个不同时期取样分析，随着果实成熟果实纵横径、单果重、可溶性固形物含量不断提高，果实硬度和细胞壁物质含量不断降低，其中的半纤维素和原果胶含量下降显著。表明杨梅果实硬度的变化与细胞壁组分尤其是半纤维素和果胶降解相关。对杨梅果实成熟过程中细胞壁降解相关酶进行活性测定，发现果胶甲酯酶（Pectinmethyltesterases，PME）活性先降后升，多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）活性先升后降，果胶裂解酶（Pectatelyase，PL）活性持续下降，β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，BGAL）活性持续上升。根据细胞壁组分含量与酶活性变化规律，筛选出与杨梅果实硬度变化的关键酶——BGAL酶。 （2）杨梅BGAL基因家族生信分析及关键成员的筛选。从杨梅基因组中鉴定出15个BGAL基因，划分为7个进化支，根据染色体位置分布依次命名为MrBGAL1-15；蛋白长度在687-892aa，分子量在76.68-100.23kDa，等电点介于5.89-8.77；BGAL家族系统发育树和基因结构、保守结构域及保守基序分析发现，所有MrBGALs蛋白序列中都存在功能性的GH35结构域。分析BGAL在杨梅果实成熟过程中的表达模式，8个MrBGAL在成熟果中表达量先升后降，2个MrBGAL在成熟果中表达量持续上升，分支A上的三个MrBGAL成熟期表达量显著高于其余分支。qRT-PCR测定分支A上三个MrBGAL在杨梅不同发育时期的表达量，发现MrBGAL10和MrBGAL11成熟期表达量显著高于青果期，推测其调控BGAL酶的合成并参与杨梅果实软化进程。 （3）MrBGAL10、MrBGAL11功能初步验证。以三个不同质地杨梅品种‘早佳’‘东魁’‘水晶’为试材，测定果实硬度、BGAL酶活性及基因表达水平。发现不同品种果实硬度均逐渐下降，BGAL活性和MrBGAL10、MrBGAL11相对表达量持续上升。果实质地最柔软的‘水晶’中BGAL活性及基因表达量均高于‘东魁’并显著高于果实质地最硬的‘水晶’，表明MrBGAL10和MrBGAL11在杨梅果实生长成熟过程中参与调控果实软化。构建35S-MrBGAL10-YFP和35S-MrBGAL11-YFP过表达载体，在番茄青熟果中进行瞬时转化验证。结果证实，番茄果实中MrBGAL10和MrBGAL11基因表达量增高后，BGAL酶活显著增强，果实硬度显著下降，证明MrBGAL10和MrBGAL11能够增加BGAL活性，参与果实质地的变化过程，降低果实硬度。
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