间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)是近些年来国内外研究的热点，它具有自我增殖、免疫调控和多向诱导分化潜能。MSCs的研究主要集中在骨髓、脂肪、骨骼、肌肉、肺、胰腺、羊水和脐带血等组织中。真皮来源的干细胞的研究相对较少。目前为止，还未见关于绵羊胚胎真皮来源的MSCs生物学特性方面的研究报道。本试验以绵羊胚胎来源的真皮间充质干/祖细胞(Dermis-derivedMesenchymalStem/progenitorCells,DMS/PCs)为研究对象，对其进行分离、培养、生物学特性和多向诱导分化潜能及鉴定进行了初步探索和研究，得出了以下结论: 1.本试验设计了三种培养体系，并根据干细胞的生长和活性状况筛选出了胎羊真皮MSCs的最佳分离方法和培养体系:以30日龄绵羊胚胎背部皮肤组织为材料，用0.25％DispaseⅡ4℃消化过夜，用机械法将表皮层与真皮层分离，再用0.25％的胰酶消化真皮层20min获得DMS/PCs,体外最佳培养体系为:L-DMEM基础培养基+10％FBS+2mML-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+100IU/mL青霉素+100μg/mL链霉素+10ng/mLbFGF+10ng/mLEGF。 2.绵羊DMS/PCs有较强的体外自我更新能力，体外培养时呈长梭形。DMS/PCs体外生长经历潜伏期、对数生长期、稳定期和衰亡期，生长曲线呈典型的“S”形，符合细胞在体外生长的一般特性和规律。在体外，DMS/PCs可以传代至第P47代，其中P3、P17、P31和P45代细胞的群体倍增时间分别为49.73h、50.36h、55.03h和58.18h,结果表明随着代次的提高，细胞增殖速度逐渐下降，40代以后细胞出现明显的衰老特征。 3.采用流式细胞仪分析P3、P23和P43代绵羊DMS/PCs的细胞周期，结果表明，随代次增加，G0/G1期的细胞比率逐渐增多，S期的细胞比率逐渐减少。 4.对体外培养的绵羊DMS/PCs进行冻存与复苏试验，共冻存细胞117支，冻存前后的细胞活率维持在92％左右。复苏后细胞存活率相对冻存前略低，其原因是细胞在冷冻和复苏过程中受到机械和化学损伤。 5.采用RT-PCR和免疫组织化学对体外培养的P3、P23和P43代绵羊DMS/PCs是否具有MSCs特异性表面标记物进行鉴定。RT-PCR和免疫组织化学检测结果表明:DMS/PCs阳性表达CD29、CD71、CD44和CD73这4种间充质类干细胞的特异性表面标记物。 6.核型分析试验表明，体外培养的绵羊DMS/PCs染色体数目2n=54,未见异常。统计结果为:细胞染色体二倍体率为92.6％,表明体外培养的细胞遗传性能稳定。 7.对体外培养的绵羊DMS/PCs进行了多向诱导分化潜能研究，在适宜的诱导条件下，绵羊DMS/PCs能够诱导为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和神经细胞，并通过特异性染色、RT-PCR和免疫组织化学三种方法鉴定所诱导的细胞为目的细胞，验证了绵羊DMS/PCs的体外分化潜能。
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