摘要
背景 本课题使用团队自拟中药复方加味茵蓝方（SYLF），通过调节肠道菌群和Toll样受体4/核因子κB（Toll-likereceptor4/nuclearfactorkappa-B，TLR4/NF-κB）信号通路干预非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholicsteatohepatitis，NASH），并探讨其潜在药理机制，以期为中医药工作者提供理论依据和用药思路。NASH是非酒精性脂肪性肝病（是Non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD）病程进展中的严重阶段，全球患病率正逐年攀升。肠道菌群失调已被证实能在NASH发病机制中通过肠-肝轴加剧其进展，成为目前研究热点。TLR4/NF-κB信号通路可以通过诱导炎症反应、氧化应激、自噬和细胞调亡等在NASH的发病机制中发挥关键作用。本研究旨在探讨SYLF通过调节肠道菌群和TLR4/NF-κB通路，干预蛋氨酸-胆碱缺乏饲料（MCD）诱导小鼠NASH的药效与潜在机制，为合理运用中药成分及新药研究提供理论依据和选择思路。 方法 1通过高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）对加味茵蓝方进行准确的定性和定量，从而获得复方中的化学成分及其相互关系。基于网络药理学方法，挖掘加味茵蓝方的中的药物靶点和NASH疾病相关靶点，构建蛋白质相互作用网络（Protein-ProteinInteractionNetworks，PPI），通过基因本体论（Geneontology，GO）功能富集和基因组百科全书（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）通路富集，筛选出核心靶点和通路。 2经一周的适应性喂养后，将60只8周龄成年健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为5组（n=12，分2笼饲养，每笼6只），第1组为空白对照组（CON），喂食维持饲料和蒸馏水灌胃；第2组为模型组（MODEL），喂食低蛋氨酸和胆碱缺乏高脂（60kcal%）鼠粮（MCD饲料），蒸馏水灌胃；第3组、第4组分别使用低剂量（SYLF-L，11.4g/kg/day）和高剂量（SYLF-H，22.8g/kg/day）加味茵蓝方：在喂食MCD饲料的同时给药；第5组为非诺贝特阳性对照组（Fenofibrate），在喂养MCD饲料的同时使用非诺贝特（40mg/kg/day）干预。实验期间观察并记录小鼠的一般情况，包括体重、进食量、毛发、活动状态等。第8周末实验结束后将小鼠麻醉后取材，收集血液、肝组织、肠组织及粪便。 3检测血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素（UREA）、肌酐（CR）的水平。 4肝组织行苏木精-伊红（HE）染色、油红O（ORO）染色并进行NAFLD组织学（NAS）评分，空肠行HE染色。 516SrRNA高通量测序法分析盲肠粪便中的微生物群。 6实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测小鼠肝脏中基因Tlr4、Rela、Nfkbia、Tnf、Il-6和Il-1β的mRNA表达水平，小鼠结肠中Tlr4、Rela、Nfkbia、Ocln、Cldn1、Cldn4、Tnf、Il-6和Il-1β的mRNA表达水平。 7蛋白免疫印迹（WesternBlot）法检测小鼠回肠中TLR4、NF-κB、磷酸化细胞内核因子kappaB（phosphonuclearfactorkappaB，p-NF-κB）、核因子κB抑制因子α（InhibitorySubunitofNF-κBAlpha，IκB-α）、闭合蛋白（Occludin）、紧密连接蛋白1（Claudin1）、紧密连接蛋白4（Claudin4）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的蛋白表达水平。 8采用GraphPadPrism8软件进行统计学分析，根据数据的正态性和方差齐性选择t检验/单因素方差分析/Kruskal-Wallistest检验。结果以mean±SD描述，P＜0.05为有统计学差异。 结果 1经过数据收集，NF-κB和紧密连接信号通路是SYLF干预NASH中的关键通路。 2血清血脂水平和肝、肾功能检测结果：MODEL组血清中TG、LDL-C、ALT、AST的水平较CON组升高（P＜0.001），HDL-C水平显著降低（P＜0.001）；各干预组TG、LDL-C、ALT、AST的水平下调（P＜0.05），血清HDL-C水平上调（P＜0.05）。血清UREA和CREA水平并无显著的统计学差异。 3肝脏组织病理学：HE染色结果显示，CON组肝细胞结构正常，肝索、肝窦排列整齐；MODEL组肝细胞体积明显增大，胞浆内含有大量脂滴，肝小叶结构紊乱，肝索拥挤、变形，并可见少量肝细胞气球样变和炎症聚集，NAS评分及其各项升高（P＜0.001）；各干预组在不同程度上恢复了肝细胞、肝索和肝小叶的正常结构，脂肪聚集、气球样变和炎症也得到了改善，NAS评分均降低（P＜0.05）。 4肝脏脂质沉积：ORO染色结果显示，MODEL组出现大量红色脂滴的着色（P＜0.001），各干预组均显示出明显疗效（P＜0.001）。 5肠道菌群检测：与CON组比较，在门水平上，MODEL组小鼠的厚壁菌门相对丰度升高，拟杆菌门降低；厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidota，F/B）比值升高，罗姆布茨菌属（Romboutsia_B）、丹毒梭菌属（Erysipelatoclostridium）、Kineothrix属、消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）相对丰度显著增加，紫单胞菌属（Muribaculum）降低。与MODEL组相比，在低或高剂量的SYLF干预后，这些菌群的丰度均在不同程度有所恢复，并且阿克曼氏菌经过干预显著上调。 6肝脏RT-qPCR：MODEL组小鼠肝脏中Tlr4、Rela、Nfkbia、Tnf、Il-6和Il-1b的mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），在低、高剂量SYLF干预后趋于正常（P＜0.05）。 7空肠组织病理学：HE染色结果显示，与空白对照组相比，模型组空肠绒毛结构形态存在显著异常改变。肠绒毛萎缩甚至脱落，杯状细胞减少，隐窝萎缩；经低、高剂量SYLF干预后肠绒毛结构逐渐恢复，肠绒毛长度增加，杯状细胞增多，隐窝深度增加。 8回肠WB：MODEL组小鼠回肠中Occludin、Claudin1和Claudin4的蛋白表达水平较CON组显著降低（P＜0.01），经低、高剂量SYLF处理后显著增加（P＜0.05）。TLR4、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IκB-α蛋白表达水平显著高于CON组（P＜0.05），在低、高剂量SYLF干预后恢复正常水平（P＜0.05）。TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平明显高于CON组（P＜0.01），经低、高剂量SYLF治疗后显著降低（P＜0.05）。 9结肠RT-qPCR：MODEL组小鼠结肠中Ocln、Cldn1、Cldn4的mRNA表达水平显著降低（P＜0.001），Tlr4、Rela、Nfkbia、Tnf、Il-6和Il-1b、Tnf、Il-6和Il-1b的mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），在低、高剂量SYLF干预后趋于正常（P＜0.01）。 结论 1SYLF能显著减轻NASH小鼠肝脂肪变性、小叶炎症和气球样变，能减少TG积累，降低ALT、AST，具有干预NASH的生物学活性。 2SYLF能通过增加拟杆菌门、紫单胞菌属、阿克曼氏菌丰度，降低厚壁菌门、罗姆布茨菌、罗姆布茨菌、消化链球菌，F/B比值等发挥调节NASH的作用。 3SYLF能修复受损的肠道屏障，通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的异常激活和炎症因子起到干预NASH的作用。
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