摘要
低聚半乳糖(GOS)是一种功能性低聚糖，能够被各种双歧杆菌良好利用，也能促进有益菌如乳酸杆菌的增殖，对有害菌如肠杆菌、肠球菌、梭菌等都有良好的抑制效果。GOS具有较强的耐酸、耐热性，不会因为在加工过程中的高温杀菌及人体胃酸分解而失去活性。GOS有着比其他功能性低聚糖更优良的性质，能够适应更多的食品种类和更广的消费群体，有巨大的应用价值和市场潜力。目前GOS的生产主要以微生物来源的β-半乳糖苷酶进行酶法催化而获得。 本研究以来源于亮白曲霉(Aspergilluscandidus)的性质优良的β-半乳糖苷酶LACB为研究对象，在已建立的毕赤酵母饱和突变体库及筛选平台基础上，进一步对突变体转糖苷活力的筛选方法进行了优化，并使用该方法重新评估了先前构建的六个氨基酸位点的突变体库。结果表明这六个氨基酸位点对转糖苷活力的影响呈现三种情况:第一类为保守性位点D239与Y241，这两个位点突变后，所有突变体的水解活力和转糖苷活力都大幅下降;第二类为次要位点S240,该位点突变为其他氨基酸后对GOS产量的影响不明显;第三类为主要位点S219、F245和E785,这些位点突变后，各突变体的GOS产量变化幅度很大。本研究选定这三个主要位点，通过Overlap-PCR分别进行双点组合突变，发现S219/E785双点组合突变能够提高GOS产量，而F245/E785双点突变体与S219/F245双点突变体均导致GOS产量降低。 从以上突变体库中筛选出11个转糖苷活力较高的突变体，分别为S219G/E785V、S219A/E785V、S219N/E785V、S219V/E785V、F245R、F245G、F245K、S219E、S219G、S219D和E785V。结果表明，与野生型酶相比，这些突变体催化生成GOS的速率都较快，而且高聚合度的GOS(四糖以上)产量明显增加，最高GOS产量和GOS转化率也都有提高。其中S219G/E785V突变体其GOS生成速率较野生酶提高了211％。当采用26％(w/v)的乳糖为底物，S219G/E785V突变体在反应7h后即达到最高GOS产量70.3mg/mL,而野生酶在反应48h后才达到最高GOS产量60.7mg/mL,消耗乳糖转化为GOS的得率由野生酶的43.6％提高到57.1％,GOS转化率由23％提高至27％。酶学性质研究表明这些突变体最适温度与最适pH没有发生明显改变，但以oNPG为底物的比活力、动力学参数Km、kcat及kcat/Km都发生较明显变化，以S219G/E785V为例，其比活力较野生酶提高45.3％,Km值由野生酶的1.63变为1.52,kcat由90.7变为127.5,kcat/Km由55.6变为83.9。 以野生酶蛋白三级结构为基础，通过分子动力学模拟预测突变体的蛋白质三级结构，从蛋白质结构层面揭示了D239、S240、Y241、S219、F245及E785对β-半乳糖苷酶LACB转糖苷反应的影响。另外，本研究对亮白曲霉β-半乳糖苷酶的固定化条件也进行了初步探索。
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