摘要
自2010年4月以来，在中国种（蛋）鸭群中出现了一种以卵巢出血，并导致产蛋鸭产蛋量下降为主要特征的新型疾病，研究证明该疾病是由鸭坦布苏病毒（DuckTembusuvirus,DTMUV）所引起的。该疾病波及范围之广，从个别省份发生到全国主要养鸭区域全面爆发，对中国养鸭业造成了巨大的威胁和严重的经济损失。作为新发疾病，对于预防该疾病的疫苗还未研究成功并投入使用。因此，病毒的研究以及疫苗的研发具有重要意义。 本研究中将本实验室已分离并鉴定的一株鸭坦布苏病毒Du/CH/LSD/110128通过尿囊腔途径接种9-11日龄SPF鸡胚进行连续传代适应，并在传代过程中，每20代对病毒尿囊液通过血凝实验和RT-PCR方法检测病毒的存在，并通过测定鸡胚半数感染量（EID50）确定病毒滴度。随着传代代次的增加，可以观察到其可以在鸡胚中稳定增殖，并导致鸡胚产生典型性的病变。 为了研究不同代次鸡胚适应毒致弱情况以及对SPF雏鸭的致病性变化，本研究将雏鸭分成五组（亲本毒组20只，其他组各15只），将Du/CH/LSD/110128亲本毒、鸡胚传代毒第50代（CF50）、70代（CF70）、90代（CF90）和对照组无菌尿囊液通过脑内途径接种7日龄SPF雏鸭，于攻毒后第3天、7天、14天、21天和28天从每组中捕杀三只并采集17个组织器官样品，并通过TaqManReal-timeRT-PCR方法检测样品中病毒载量，了解病毒的组织分布和变化情况，同时根据鸭群发病率、死亡率、临床症状和剖检病理变化分析鸡胚适应毒对SPF雏鸭的致病性并与亲本毒进行比较。结果证明该鸭坦布苏病毒在机体内广泛分布，组织器官中的病毒载量随着攻毒后时间的增加而逐渐减少，病毒传代代次的增加也使得组织器官中的病毒载量逐渐减少;而且，与Du/CH/LSD/110128亲本毒和其他代次病毒相比，CF90攻毒后鸭群未表现出发病症状和病理变化。 为了研究DTMUVDu/CH/LSD/110128鸡胚传代致弱病毒免疫原性，本研究将雏鸭分成四组（亲本毒组和阴性对照组10只，其他两组各8只），将亲本毒、CF70、CF90以及对照无菌尿囊液分别通过脑内途径接种7日龄SPF雏鸭，在攻毒后第5天，10天，15天，20天，25天和30天经腿部静脉采集接种鸭外周血，利用实验室已建立的间接ELISA方法，并与westernblot方法进行比较，检测抗体阳转情况，由结果可知不同代次鸡胚传代毒攻毒后血清均从第5天起开始转阳，CF90攻毒后血清抗体阳性率上升速度缓慢，25d时升高到100％。免疫保护试验表明，Du/CH/LSD/110128CF90可以对亲本毒的攻击产生有效的保护。由此可见，鸡胚传代毒CF90通过在鸡胚上的连续传代已经完全致弱，并且免疫原性也未发生变化，可以作为疫苗候选株。 为了对Du/CH/LSD/110128株鸡胚传代适应过程中基因组的变化进行研究，对各代次鸡胚传代毒CF30、CF50、CF70以及CF90全基因组进行测序，并与亲本毒进行核苷酸序列以及氨基酸序列比对，结果显示在传代适应过程中病毒基因组发生了变化，其中有义突变共14个，分别在Caspid、prM、Envelope、NS1、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白，而且各鸡胚传代毒在基因组终止密码子下游都存在一段72个碱基的缺失，推测NS1、NS3和NS4A蛋白中发生的氨基酸位点突变与Du/CH/LSD/110128毒株的鸡胚适应能力、病毒复制能力以及对雏鸭的致病力的变化有关。
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