摘要
p53作为明星分子，1979年被首次发现以来，已经有40多年的历史，并且一直都是引人注目的癌症靶点。由于p53作为转录因子，在未刺激状态下的半衰期很短；而在外界刺激下会被活化并调控下游靶基因的表达，从而启动多种抵抗细胞增殖的调控程序。目前，p53通路激活剂的药物研发一直都在推进，而其中针对野生型p53的药物研发，首先是基因治疗，但是存在一定的局限性，难点在于如何提高药效和安全性。相比直接激活p53蛋白，干扰其主要负调控因子MDM2功能显得更加容易，也作为当下研究热点。由于MDM2不仅作为p53下游靶基因，又可以作为p53的负调控因子，通过与p53直接结合，使其发生泛素化降解，对p53信号通路起抑制作用，所以两者形成MDM2-p53信号环路。目前，针对干扰MDM2癌蛋白功能的相关研究主要分为三个方向：靶向抑制p53-MDM2相互作用，靶向抑制MDM2活性，靶向MDM2降解。鉴于前两个方向的药物研发陷入瓶颈，所以靶向MDM2的降解成为该领域重要的研究方向。USP7（Ubiquitinspecificprotease7）是目前研究较多的去泛素化酶之一，既可以对MDM2进行去泛素化修饰，又可以对p53进行去泛素化修饰，没有外界压力存在下，MDM2较p53表现出更高的结合亲和力，USP7先于MDM2结合来激活p53信号通路。同时，USP7在多种癌症中高表达，并有助于癌症的发生和发展。抑制USP7激酶活性可以促使MDM2蛋白降解，从而达到激活p53信号通路来抑制肿瘤细胞增殖的目的。综上，本文以抑制MDM2蛋白表达为出发点，分为五个部分对于USP7-MDM2-p53信号通路进行抗肿瘤药物筛选和机制研究。 第一部分： 该部分研究，基于USP76VN2晶体结构的药效团模型进行虚拟筛选和生物学评价，用于发现针对USP7催化活性位点的小分子抑制剂。从Specs数据库和home-lab数据库（215,480个小分子化合物）中通过药效团过滤和分子对接打分筛选出候选化合物TS-4，发现其对USP7激酶具有一定的抑制活性。同时通过细胞实验初步研究表明，与人正常结肠细胞株（CCD841CoN）相比，其对人结肠癌细胞株（HCT116和RKO）具有抵抗细胞增殖的活性。接着通过分子动力学模拟揭示了USP7与TS-4的结合作用模式，TS-4与Tyr224、Phe409和Tyr514形成稳定的相互作用，这对增强TS-4的生物学活性至关重要。总的来看，这部分的研究证明化合物TS-4可作为一种有前景的候选化合物，对于新的USP7抑制剂的开发起着促进作用。 第二部分： 该部分是基于前期药效团筛选出的黄酮类似物的结果，探究是否存在天然黄酮化合物能抑制USP7激酶活性，并且激活p53信号通路。从实验室黄酮库（160个）中筛选出来28种抑制USP7激酶活性和32种激活p53荧光素酶报告系统的黄酮化合物，其中有4个黄酮化合物可以同时符合这两个筛选条件，但是通过WesternBlotting进一步检测相关蛋白表达，发现只有栀子黄素B可以明显地提高p53蛋白水平，并激活下游信号通路（p21靶蛋白表达水平提高），同时抑制HCT116结肠癌细胞生长最为显著。更进一步，通过分子对接和分子动力学模拟验证了栀子黄素B与USP7之间的结合模式。但是比较遗憾地是，栀子黄素B却不能引起MDM2蛋白表达的减少，毕竟药物对细胞中蛋白表达不是单一的调控，存在多种通路的相互作用。为了探究筛选系统命中获得的其他黄酮化合物生物活性，在通过直接检验p53信号通路相关蛋白表达的过程中，我们发现4’,7-二甲基柚皮素和扁柏双黄酮可以明显地降低MDM2的蛋白表达，同时强烈地提高p53蛋白表达水平，这就预示着它们可作为MDM2蛋白降解剂来进行后期深入的机制研究。 第三部分： 4’,7-二甲基柚皮素的药效与药理研究结果表明，它可以强烈地抑制HCT116细胞的增殖，进一步发现其依赖于野生型p53来发挥抗肿瘤机制，最终诱导HCT116发生细胞凋亡和G2/M周期阻滞。进一步证明，尽管4’,7-二甲基柚皮素以剂量和时间依赖性的方式下调MDM2蛋白表达，但是对mdm2mRNA的转录水平不会造成影响，探究原因是其抑制了mdm2转录后的蛋白合成过程。最后我们试图通过CETSA、DARTS实验手段和计算机辅助靶点预测等方式去分析其可能的直接靶标，为后期的靶点研究提供一定的数据基础。总之，该部分的研究证明4’,7-二甲基柚皮素通过下调MDM2蛋白表达激活p53通路，是一种潜在的治疗结肠癌的天然黄酮化合物。 第四部分： 扁柏双黄酮的药理学研究结果表明，它是一个新的MDM2天然产物降解剂，更具体地说，我们发现扁柏双黄酮通过直接抑制mdm2基因的转录，导致mRNA相对水平下降，进而造成MDM2蛋白表达减少，最终激活p53信号通路，诱导细胞凋亡和G2/M周期阻滞，达到降低HCT116细胞存活率的目的。接着通过文献调研，MolTarget靶点预测、KEGG通路分析和GO分析提示ESR1是扁柏双黄酮导致mdm2mRNA下降的一个关键因素。最后，我们利用分子对接和分子动力学模拟验证了扁柏双黄酮和ESR1的结合作用。总的来说，扁柏双黄酮通过下调mdm2mRNA水平，激活p53信号通路，是一种可行的天然MDM2降解剂，对抗肿瘤天然产物的药物开发有着促进作用。 第五部分： 为了更好地了解第四部分中不同双黄酮衍生物的差别，该部分研究发现银杏类双黄酮（7-去甲基银杏双黄酮、异银杏双黄酮和银杏双黄酮）有着类似的减少MDM2蛋白表达和提高p53蛋白表达的作用。出人意料地，我们发现这些化合物尽管可以提高p53蛋白水平，但是却不能激活p53信号通路（BAX，p21和PUMA等p53的靶蛋白表达水平并没有上调）。我们通过qPCR，EMSA和ChIP等实验去证明p53蛋白作为转录因子的功能是否受到抑制，结果发现7-去甲基银杏双黄酮和银杏双黄酮的确导致p53不能发挥转录因子的作用，但是异银杏双黄酮对于p21的抑制是发生在转录后的蛋白合成上。对于MDM2的表达我们得出了7-去甲基银杏双黄酮和银杏双黄酮影响转录过程导致MDM2蛋白合成减少，而异银杏双黄酮影响转录后合成过程的结论。我们测其对p53野生型（WT）、突变（MUT）或缺失（NULL）的结肠癌细胞的细胞毒作用，发现p53野生型的状态在细胞死亡中发挥关键作用。为了寻找银杏类双黄酮依赖于p53野生型状态发挥抗肿瘤的原因，我们进一步发现它们对HCT116结肠癌细胞G2/M期产生周期阻滞，引发细胞早期凋亡，同时又促进活性氧的产生；紧接着实验证明细胞内铁含量的上升和还原型谷胱甘肽的下降，会导致细胞发生了另外一种程序性死亡——铁死亡（ferroptosis）。我们通过RNAseq分析和ferroptosis数据库分析，将实验的重点放在了对铁死亡有促进作用的HMGB1蛋白上，同时发现在银杏双黄酮处理后，该蛋白发生明显的核移位现象，为之后探究银杏双黄酮带来的铁死亡现象起着一定的参考意义。同时，我们在细胞水平和裸鼠移植瘤模型中证明银杏双黄酮与5-FU联用后可以更好地抑制肿瘤生长。总的来说，银杏类双黄酮可以带来更多的药物疗效，对天然产物药物抗肿瘤的研发有着很好的促进效果。 综上所述，与我们发现与针对单一靶点而命中的小分子化合物相比，大多数天然产物具有更为广泛的靶点，从食用和药用植物中提取的天然产物在临床前和临床研究中都显示出了强效的癌症化学预防和化疗活性。4’,7-二甲基柚皮素、扁柏双黄酮、7-去甲基银杏双黄酮、异银杏双黄酮和银杏双黄酮作为MDM2降解剂在我们的筛选过程中脱颖而出，同时银杏类双黄酮独特的作用机制值得我们进一步深入的研究。
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