摘要
目的:肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一。其发生发展的复杂性给HCC的诊疗带来了极大挑战。随着人们对HCC研究的不断深入，手术、化疗、放疗、靶向药等已经应用于HCC的治疗，但中晚期HCC治疗难度大，复发率及死亡率仍在不断上升。鞣花酸(Ellagicacid,EA)是一种植物来源的天然酚类化合物，有四个羟基官能团和两个内酯官能团，其化学结构的特殊性，可以参加多种氧化还原反应,让其具有强大抗氧化抗炎能力。恶性肿瘤的发生往往伴随着氧化应激及炎症反应，抗氧化抗炎制剂在肿瘤治疗中已经显示了其巨大潜力。本研究旨在探讨EA干预在HCC中的作用，并和索拉非尼联合应用后观察对索拉非尼抗HCC肿瘤效应的可能协同作用。 方法:(1)选取人HCC细胞系Huh7和Hep3B细胞进行体外实验，给予EA(0uM,10uM,20uM,40uM,80uM)、索拉非尼(0uM,1.25uM,2.5uM,5uM,10uM)单药处理细胞后用CCK-8检测细胞活力，EdU检测细胞增殖能力，克隆形成实验检测细胞克隆形成能力及流式细胞术检测细胞凋亡。通过CCK-8实验结果确定EA和索拉非尼处理细胞的最佳药物浓度后，用最佳药物浓度单独及联合处理细胞，采用CCK-8检测单药及联用药物后的细胞活力。(2)EA处理和未用EA处理的Huh7细胞行转录组测序筛选差异表达基因，KEGG分析筛选差异基因相关通路。(3)6周龄雌性裸鼠(BALB/c-nu)皮下植入Huh7细胞(3×106个/只)建立异种移植小鼠模型，皮下成瘤成功后随机将小鼠分为6组，分别为Vechile组(对照组)和EA组(剂量60mg/kg灌胃);Vechile组、EA组(剂量30mg/kg)、索拉非尼组（剂量30mg/kg）和EA+索拉非尼（剂量10mg/kg）组，每组6只，分别给予EA、索拉菲尼及两种药物联合灌胃治疗小鼠，连续治疗9天，观察肿瘤生长速度及大小变化。TUNEL法检测小鼠肿瘤组织中细胞凋亡情况。（4）蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测细胞和肿瘤组织中凋亡蛋白C-PARP、C-Caspase3和Bax,以及信号通路相关蛋白ERK、JNK和p38以及Akt和mTOR的磷酸化蛋白的表达水平。 结果:（1）EA、索拉非尼单药处理后的Huh7和Hep3B细胞与对照组相比，生长速度变慢、细胞活力降低、细胞增殖受到抑制、细胞凋亡水平升高，凋亡相关蛋白C-PARP、C-Caspase3和Bax水平均升高;（2）EA处理Huh7细胞4天后，转录组测序分析KEGG富集的信号通路显示MAPK和AKT/mTOR信号通路出现在显著富集的前15个。EA干预Huh7和Hep3B细胞后MAPK和Akt/mTOR信号通路的ERK、JNK和p38，以及Akt和mTOR的磷酸化蛋白表达降低;（3）EA联合索拉非尼处理组的细胞活力较索拉非尼单药处理组进一步降低，MAPK和Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达下调趋势跟细胞活力趋势一致;（4）经EA单独治疗的异种移植小鼠肿瘤生长速度较对照组减慢，肿瘤体积较对照组减小;（5）EA联合索拉非尼治疗组小鼠的肿瘤生长速度较EA、索拉非尼单独治疗组肿瘤生长速度比较，Vechile组＞EA组＞索拉非尼组＞EA+索拉非尼组;（6）与对照组比较，EA明显增加Huh7荷瘤小鼠肿瘤组织细胞凋亡率及凋亡相关蛋白C-PARP、C-casepase3、Bax蛋白水平。EA与索拉非尼联合用药进一步增加Huh7荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡率。（7）EA和索拉非尼单药治疗组小鼠肿瘤ERK、JNK和p38以及Akt和mTOR的磷酸化蛋白表达较对照组降低，联合用药组磷酸化蛋白水平较单药组进一步降低，P＜0.05。 结论:本研究体内外实验证实了EA可抑制HCC细胞增殖、促进细胞凋亡，具有抗HCC的作用，该作用可能与抑制MAPK和Akt/mTOR信号通路相关。此外，本研究发现EA可以增强HCC肿瘤对索拉非尼的敏感性，这一效应可能由于EA和索拉非尼联合使用后可进一步抑制MAPK和Akt/mTOR信号通路蛋白的表达。本研究结果表明EA具有抗HCC肿瘤效应并增强HCC对索拉非尼的敏感性，从而为EA在HCC中的临床应用提供理论依据和实验基础。
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