摘要
帕金森病(Parkinson''sdisease，PD)是全球第二大神经退行性疾病，其病理特征复杂且多变，常见的包括黑质部位多巴胺能神经元的选择性丢失，黑质-纹状体通路胶质细胞的反应性激活以及神经元内出现包含异常折叠的α-突触核蛋白(α-synuclein)多聚体的路易小体(Lewybody)。帕金森病的发病被认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果。不同的病因导致了帕金森病的多种亚型，并极大地挑战了帕金森病的诊断和治疗。神经炎症(Neuroinflammation)作为多种PD亚型中共同的表型之一，受到广泛关注。近年来越来越多的研究显示通过调节神经炎症可以显著改善PD的病理进程，因此减轻神经炎症有望成为治疗PD的新靶点。 白细胞介素-33(Interlukin-33,IL33)是一个广泛表达于多种组织和细胞中的细胞因子，对免疫反应、肿瘤的发生与发展具有重要作用。在中枢神经系统(Centralnervoussystems,CNS)中，IL33主要在星形胶质细胞和少突胶质细胞内表达，对神经免疫和CNS疾病的发病具有重要影响。正常情况下，IL33作为核因子在细胞核内与染色质结合发挥稳态维持作用;受到外界刺激时，IL33可以作为警报素(Alarmin)被分泌到细胞外，调节多条信号通路(MAPK、NF-κB等)的激活以及多种细胞因子(IL1、TNFα以及IL4等)的表达。IL33介导的神经炎症在PD中的作用及机制尚不清楚。本课题中，我们研究了PD细胞模型和小鼠模型上IL33表达的变化规律，系统性地分析了IL33对多巴胺能神经元存活以及胶质细胞反应性激活的影响，并且深入探讨了其中的机制。 研究中，采用腹腔注射1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)和黑质部位立体定位注射AAV-α-synA53T的方法，在野生型(WT)小鼠和Il33敲除小鼠(Knockout,KO)上分别建立神经毒素诱导的和α-synA53T过表达诱导的PD小鼠模型，并通过腹腔注射重组IL33蛋白(RecombinantIL33，rIL33)对PD小鼠进行干预。运用RNA-seq、蛋白质谱、生物化学、分子生物学、组织学和图像学等研究手段，综合分析小鼠黑质-纹状体通路中多巴胺能系统的损伤、胶质细胞的反应性激活情况，并检测了小鼠的运动协调行为。在体外，利用培养的WT和KO小鼠的原代胶质细胞和神经元，建立PD细胞模型，研究LPS刺激的WT和KO小胶质细胞中炎症相关分子的转录水平，LPS刺激的混合胶质细胞中信号通路的激活以及促炎分子的表达，并研究rIL33对MPP+刺激的原代神经元以及混合胶质细胞条件培养基(Conditionedmedium，CM)对神经元的影响。 主要研究结果如下: 1.动物实验 1)MPTP建模后，小鼠纹状体部位IL33阳性星形胶质细胞的占比显著增加; 2）与MPTP建模WT小鼠相比，Il33缺失加重了小鼠黑质-纹状体通路的损伤，体现在:多巴胺能系统损伤加重，小胶质细胞的反应性激活更加明显（更多的数量，胞体面积更大），小鼠运动起始能力以及运动协调能力受损更为严重; 3）与α-synA53T过表达WT小鼠相比，Il33缺失加重了小鼠纹状体TH蛋白表达的减少，进一步增加了黑质部位小胶质细胞的数量，加重了小鼠的运动障碍; 4）RNA-seq结果显示，与MPTP建模的WT小鼠相比，MPTP建模的KO小鼠其纹状体组织中氧化磷酸化通路以及NF-κB通路被显著富集;钙离子信号通路以及凋亡通路等被上调，相反地，趋化因子通路和甲状腺激素合成等通路被下调; 5）蛋白质组学结果表明，与MPTP建模的WT小鼠相比，MPTP建模的KO小鼠其纹状体中，多巴胺能神经突触、坏死性凋亡、帕金森病、p53信号通路、趋化因子信号通路以及氧化磷酸化等通路被显著富集。 6）腹腔注射rIL33可以显著改善PD小鼠黑质-纹状体通路的损伤，包括减轻多巴胺能系统损伤，减少了小胶质细胞以及星形胶质细胞的数量，并且改善了小鼠运动行为; 2.细胞实验 1）在LPS刺激的原代小胶质细胞中，Il33缺失进一步上调了Ifnγ、Il1α、Il1β以及Nlrp3的转录水平; 2）在LPS刺激的原代混合胶质细胞中，Il33缺失更加激活NF-κB信号通路以及IL1β、COX2和NLRP3蛋白的表达，增加了细胞上清液中一氧化氮（NO）的浓度;利用吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）抑制NF-κB信号通路激活后，IL1β和COX2蛋白表达在基因型间的差异消失，并且两种基因型混合胶质细胞上清液中NO的浓度也不再表现出差异; 3）RNA-seq结果显示，与LPS刺激的WT原代混合胶质细胞相比，Il33缺失的原代混合胶质细胞中Il18、Il1β、Il1α、载脂蛋白A（Apoa1)以及Il6等基因表达均有不同程度的上调，多种Ⅰ型胶蛋原白Col1a1、Col3a1以及Col7a1,基质金属蛋白酶Mmp2、Mmp25,成纤维细胞生长因子Fgf7、Fgf10以及血清素受体Htr2b的表达减少，趋化因子及其受体Ccl8、Ccl12、Ccr5表达也下调，提示细胞间的交流（Communication）减弱，可能不利于炎症的清除; 4）用PBS或者LPS处理的混合胶质细胞，收集条件性培养基（CM或LCM）刺激原代培养的神经元，相比于WTLCM,Il33缺失的LCM刺激组对神经元的损伤更严重; 5）用rIL33提前干预原代培养的神经元2小时后再给予MPP+刺激，rIL33提前干预显著增加了原代神经元的存活。 综上所述，IL33对神经炎症的发展以及神经元的存活具有重要作用。Il33基因缺失可进一步增加PD建模小鼠黑质-纹状体通路中多巴胺能系统的损伤，小胶质细胞反应性激活，并且加重小鼠的PD样行为。rIL33的应用则显著改善了小鼠的PD表型。本课题从体内、体外多个层面分析了IL33参与调节的神经炎症在帕金森病中的作用及机制，研究也为rIL33治疗和干预PD的潜能提供了实验依据。
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