摘要
香气是评价葡萄酒品质的重要依据，具有典型香气特征的葡萄酒往往也具有更强的市场竞争力。近年来非酿酒酵母（NS）对葡萄酒香气的修饰作用受到了广泛的关注，利用NS酵母与酿酒酵母进行混菌发酵是提升葡萄酒典型香气特征的有效途径。宁夏贺兰山东麓产区是中国五大葡萄酒地理标志产品保护区之一，然而产区存在商业酿酒酵母过度使用的现象，也缺乏对本土NS酵母的开发与利用，导致了葡萄酒香气风格缺失的问题。因此，本课题首先采用非培养组和可培养组相结合的方法明确贺兰山东麓产区葡萄酒自然发酵过程中的核心NS酵母种类;然后通过多级筛选策略获得具有增香潜力的本土NS酵母菌株;随后将本土NS酵母与商业酿酒酵母进行混菌发酵，或添加本土NS酵母衍生物与商业酿酒酵母进行酒精发酵，探究本土NS酵母对葡萄酒香气的修饰作用;最后基于转录组测序和气相色谱-质谱技术对本土NS酵母的增香机制进行解析。主要研究结果如下: （1）从宁夏贺兰山东麓银川、玉泉营和青铜峡三个子产区采收主栽酿酒葡萄品种赤霞珠进行自然发酵，通过高通量测序技术对微生物的群落组成和演替规律进行分析。结果表明，自然发酵期间细菌和真菌的群落结构均发生了显著性变化，其中细菌多样性水平先降低、后升高，真菌多样性水平持续降低。Hanseniaspora是相对丰度最高的NS酵母属，在自然发酵的第2d占据种群优势地位。对分离得到的360株酵母的26SrDNAD1/D2区进行扩增和测序，进一步确定了葡萄汁有孢汉逊酵母（H.uvarum）是最主要的NS酵母种，占NS酵母总数的77.49％。 （2）通过感官一筛、酶活二筛、耐受性三筛和产香四筛的多级筛选策略，从148株宁夏本土H.uvarum中筛选得到1株兼具良好发酵性能和增香潜力的菌株QTX-C10。QTX-C10在模拟葡萄汁中可以耐受80mg/L的二氧化硫、280g/L的葡萄糖和6vol％的乙醇。QTX-C10生长所需碳源主要为六碳糖，氮源主要为酸性氨基酸和有机氮。QTX-C10的基因组大小为8.89Mb,包含3,273个蛋白编码序列，具备完整的葡萄酒二类香气成分合成相关基因。比较基因组分析表明,H.uvarum具有开放的泛基因组，种群特异性和环境适应性较强;QTX-C10与H.uvarumNRRLY-1614、NCYC2739和H2O的亲缘关系最近;QTX-C10特有基因的功能与细胞絮凝、转运蛋白、结构蛋白和氨基酸代谢相关。 （3）以灭菌葡萄汁为试材，按照不同接种方案将QTX-C10与宁夏本土商业酿酒酵母CECA进行混菌发酵，确定了QTX-C10与CECA按1∶1比例同时接种的最佳方案。基于此方案，以不同年份（2022年和2023年）、不同子产区（银川和青铜峡）以及不同品种（赤霞珠和霞多丽）的酿酒葡萄为原料进行发酵小试，揭示了QTX-C10与CECA混菌发酵具备提升葡萄酒乙酯含量的作用。在中试生产中，QTX-C10与法国商业酿酒酵母ExcellenceXR混菌发酵提升了赤霞珠干红葡萄酒52.39％～72.25％的乙酯含量，增强了葡萄酒果香味的典型香气特征，提升了葡萄酒香气的浓郁度、优雅度和整体品质。 （4）以灭菌葡萄汁为试材，按照不同添加方案将QTX-C10的四种衍生物与CECA进行酒精发酵，确定了细胞自溶物、胞内代谢物、细胞壁多糖和胞内酶的最佳添加方案分别为SAL、AMH、AWH和AEL。基于上述方案，以不同年份（2022年和2023年）、不同子产区（银川和青铜峡）以及不同品种（赤霞珠和霞多丽）的酿酒葡萄为原料进行发酵试验，结果表明SAL能够提升葡萄酒的乙酯和萜烯含量，AMH能够提升脂肪醛含量，AEL能够提升萜烯和芳香烯含量。 (5)基于转录组测序和气相色谱-质谱技术提出了H.uvarum增香的两种可能方式:其一，在混菌发酵中H.uvarum促进了酿酒酵母乙酰CoA羧化酶基因ACC1、脂肪酸合成酶基因FAS1以及酯酶基因EEB1和EHT1的表达，进而提升乙酯产量;其二，H.uvarum失活自溶后向发酵基质中释放细胞脂质，促进了酿酒酵母脂酰CoA合成酶基因FAA1以及酯酶基因EEB1和EHT1的表达，进而提升乙酯产量。 综上所述，H.uvarum在宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的NS酵母中拥有核心地位;H.uvarum与酿酒酵母进行混菌发酵具有提升葡萄酒乙酯含量和增强葡萄酒果香味典型香气特征的作用;混菌发酵和H.uvarum自溶物均能够促进酿酒酵母乙酯合成相关基因的表达，从而提升乙酯产量。
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