摘要
背景:桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤等作用。黑色素瘤是所有肿瘤中增长速度最快的恶性肿瘤，免疫治疗目前是黑色素瘤治疗重要方法。桔梗中含有多种活性化合物，包括皂苷、多糖和黄酮类化合物等，这些成分表现出良好的抗癌效果。目前随着对肿瘤发病机制的深入研究，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境中非常重要的免疫细胞亚群，越来越多的研究表明TAM是以M2型存在于肿瘤微环境，具有支持肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等一系列促进肿瘤发展的功能，与肿瘤患者的不良预后呈高度相关性。但桔梗发挥抗肿瘤作用是否与其参与调控肿瘤微环境有关尚未见报道。基于以上研究背景，我们提出科学问题:桔梗及其活性成分能否通过调节肿瘤浸润巨噬细胞发挥抗黑色素瘤的作用，如果是桔梗及其活性成分调节M2巨噬细胞的哪些生物学功能，并且明确桔梗及其活性成分调控巨噬细胞极化的分子作用机制。为了回答上述科学问题，我们开展以下研究: 目的与方法: (1)为了探究桔梗水提物及其活性成分对黑色素瘤增殖影响以及初步观察对黑色素瘤组织中M2巨噬细胞的浸润情况，应用C57BL/6J小鼠构建黑色素瘤模型，通过免疫组化、Western-blot等方法检测桔梗水提物对荷瘤小鼠肿瘤浸润巨噬细胞、肿瘤增殖、增殖相关mTOR信号通路的影响，通过HPLC-MS技术检测桔梗水提物在肿瘤小鼠入血成分，进一步的清除巨噬细胞观察主要活性成分桔梗素D对黑色素增殖的影响。 (2)为了深入探讨桔梗水提物与活性成分桔梗素D影响M2巨噬细胞的生物学功能，以含桔梗的血清以及桔梗素D为材料，体外培养小鼠骨髓来源巨噬细胞诱导其M2极化，采用qRT-PCR、流式细胞术、线粒体压力测试、JC-1染色等观察含桔梗血清及其活性成分桔梗素D对M2型BMDMs的极化和线粒体功能的影响。通过CCK8、结晶紫染色、软琼脂克隆、Western-blot检测mTOR相关蛋白，明确桔梗及其活性成分对M2巨噬细胞促肿瘤作用的影响。 (3)为了进一步研究桔梗及其活性成分桔梗素D调控M2巨噬细胞功能的分子机制，应用网络药理学进行预测桔梗水提物对巨噬细胞细胞极化的靶点，然后利用western-blot技术检测相关蛋白、免疫共沉淀(CO-IP)、免疫荧光等技术明确桔梗调控M2型巨噬细胞极化的分子机制 结果: (1)桔梗水提物可以抑制黑色素瘤的质量以及肿瘤增殖标志物Ki67的表达，抑制黑色素瘤浸润的M2型巨噬细胞标志物CD206的表达，促进M1巨噬细胞标志物CD86的表达，并且抑制肿瘤增殖通路mTOR下游P70S6K和4EBP的磷酸化水平。利用HPLC-MS技术在桔梗水提物中检测出60个化学成分，桔梗水提物灌胃黑色素瘤小鼠，检测血清中的桔梗的入血成分，共检测到了31个入血成分，如PlatycodinD、PlatycosideA、PlatycosideH、PolygalacinD等。并且桔梗素D也可以抑制黑色素瘤的质量以及肿瘤增殖标志物Ki67表达，抑制M2巨噬细胞的浸润，以及mTOR相关通路下游P70S6K和4EBP的磷酸化水平。进一步利用巨噬细胞清除剂清除小鼠巨噬细胞，发现桔梗素D对肿瘤的抑制作用被部分拮抗。 (2)在体外培养BMDMs诱导M2型巨噬细胞以模拟肿瘤浸润巨噬细胞，诱导条件为20ng/mLIL-4,处理16h可以成功构建M2巨噬细胞。桔梗素D可以抑制M2型BMDMs的极化标志物Arg1、FIZZ1、YIM1的mRNA表达，但不影响M2型BMDMs的细胞活力。桔梗素D抑制M2型BMDMs细胞的线粒体呼吸作用、ROS水平、线粒体超微结构、线粒体膜电位抑制线粒体功能。并且抑制黑色素瘤细胞的增殖、成瘤能力以及增殖通路mTOR下游P70S6K和4EBP的磷酸化水平。含桔梗血清也具有类似的功能，含桔梗血清可以抑制M2型BMDMs的极化标志物Arg1、FIZZ1、YIM1的表达，但不影响M2型BMDMs的细胞活力，抑制M2型BMDMs细胞的线粒体呼吸作用、ROS水平、线粒体超微结构、线粒体膜电位抑制线粒体功能。 (3)利用网络药理学方法预测桔梗入血成分与巨噬细胞极化靶点的交互基因，发现STAT3可能是桔梗调控肿瘤浸润巨噬细胞的核心靶点。网络药理学预测含桔梗血清中30个活性成分对巨噬细胞极化的作用机制发现STAT3,TLR4,STAT1,PIK3R1,HIF1A,NFKB1等核心靶点，其中STAT3排名第一，18个重要活性成分与4个核心靶点都有相互作用。含桔梗血清及桔梗素D可以抑制STAT3的磷酸化、JAK2本底水平，通过促进JAK2的泛素化降解抑制JAK2/STAT3信号，桔梗素D影响JAK2泛素化位点在Ub的K63位点和JAK2的K999和K1011位点。进一步的在JAK2激活剂处理与JAK2基因缺陷的BMDMs中发现可以部分逆转桔梗素D对BMDMs的M2极化的抑制作用，以及对线粒体呼吸功能的抑制作用，并且JAK2的基因缺陷小鼠中桔梗素D的抗肿瘤作用被减弱。 结论: 桔梗水提物及活性成分桔梗素D可以通过抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞的浸润进而抑制黑色素瘤的发生发展，其作用机制为通过促进JAK2的蛋白酶体-泛素化降解抑制JAK2/STAT3信号通路影响肿瘤相关巨噬细胞的线粒体呼吸功能以及M2相关基因Arg1、FIZZ1、YIM1的表达。桔梗素D是桔梗通过调控肿瘤微环境中巨噬细胞发挥抗肿瘤作用的重要活性成分之一。
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