摘要
研究背景:小胶质细胞(microglia)作为脑内常驻组织巨噬细胞，在保证中枢神经系统的正常发育和维持中枢神经系统稳态的过程中发挥重要作用。小胶质细胞发育不良可以导致多种发育性的精神疾病和神经退行性疾病，如自闭症、精神分裂症、阿尔兹海默病等，这些疾病的发病机制亟待阐明，以寻找有效防治策略。表观遗传调控能够在不改变DNA序列的情况下调控基因表达，组蛋白修饰是较为常见的一种修饰方法。组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylases,HDACs)通过去乙酰化修饰使染色质致密卷曲，抑制基因转录。组蛋白去乙酰化酶3(HistoneDeacetylase3,HDAC3)是Ⅰ类HDACs的成员之一，在大脑发育、健康脑功能的维持和神经系统疾病中发挥重要作用。目前发育过程中表观遗传调控小胶质细胞功能的研究鲜有报道，尚未见HDAC3调控小胶质细胞发育及其功能的相关研究。本课题旨在探究发育过程中HDAC3对小胶质细胞功能/稳态维持的调控作用以及对神经功能的影响。 研究方法:为了探究HDAC3在小胶质细胞发育过程中的作用，我们利用CreER-loxP系统构建在小胶质细胞发育期敲除HDAC3的转基因小鼠。通过将HDAC3fl/fl小鼠与CX3CR1CreERT+/-小鼠交配，最终得到HDAC3fl/flCX3CR1CreERT+/-实验组小鼠和HDAC3fl/flCX3CR1CreERT-/-对照组小鼠，P0天的小鼠经皮下注射他莫昔芬(Tamoxifen),分别获得发育期小胶质细胞中特异性敲除HDAC3(HDAC3-miKO-D)的转基因小鼠和野生型小鼠(wildtype,WT)，分别在P9天和P21天通过流式细胞术分选脑内小胶质细胞通过qPCR验证HDAC3敲除效果。通过流式细胞术、免疫荧光染色和小胶质细胞形态学分析等评估P9天、P21天和成年小鼠的小胶质细胞数量、形态变化。并针对HDAC3-miKO-D造成成年后的小胶质细胞的稳态异常，采用免疫组化进一步观察了成年小胶质细胞的极化表型。采用流式细胞术和免疫荧光检测不同时程的巨噬细胞浸润。利用免疫荧光和电生理评估白质发育。通过小胶质细胞形态分析和促炎型标记物CD16免疫荧光染色评估成年后Iba1+细胞稳态变化。采用Dil染色、高尔基染色及免疫荧光等评估小胶质细胞对突触吞噬以及神经元突触修剪情况等。最后通过发育期及成年后多种行为学如翻正反射、前肢悬挂、转棒实验评估小鼠运动功能，并用Y迷宫、新物体识别实验、旷场、高架十字迷宫评估情绪及记忆认知功能。综合探究了发育过程中HDAC3-miKO对小胶质细胞功能的影响及其对神经功能的作用。 研究结果:1.HDAC3-miKO-D小鼠成功构建。发育期的P9天、P21天脑内流式细胞术分选获得Iba1+细胞，Iba1+细胞qPCR结果表明HDAC3-miKO-D小鼠的HDAC3表达量显著下降，表明HDAC3-miKO-D小鼠构建成功。2.HDAC3-miKO-D影响了小胶质细胞的发育及稳态维持。Iba1免疫荧光结果显示:相对WT小鼠，由Tamoxifen注射导致的Cre酶入核(CX3CR1CreERT+/-)仅在P9天减少了Iba1+细胞数量，此时HDAC3-miKO-D组与CX3CR1CreERT+/-组并没有显著差异。而在P21天，单因素CX3CR1CreERT+/-组Iba1+细胞数量上升与WT一致;HDAC3-miKO-D组Iba1+细胞数量也呈现上升，但其上升幅度比CX3CR1CreERT+/-组略低，表现在海马CA3和DG区的Iba1+细胞显著降低。在小鼠成年后，WT和CX3CR1CreERT+/-组小鼠的Iba1+细胞数量均逐步降低，符合小胶质细胞的生理发育特点;有趣的是HDAC3-miKO-D组Iba1+细胞数量仍然持续升高，显著高于WT和CX3CR1CreERT+/-组小鼠。进一步分析各时间点Iba1+细胞的形态可见，HDAC3-miKO小鼠的Iba1+细胞呈胞体大分支短的激活态。3.HDAC3-miKO-D抑制Iba1+细胞增殖造成了发育期Iba1+细胞数量减少。凋亡标记物TUNEL/Iba1染色表示，小鼠出生后的P9和P21天未见Iba1+细胞凋亡，提示此时Iba1+细胞的数量减少与凋亡无关。增殖标记物Ki67/Iba1共标结果显示，P9天Iba1+细胞数量减少的主导原因是Cre酶入核(CX3CR1CreERT+/-组)抑制了小胶质细胞的增殖，但HDAC3-miKO-D小鼠Ki67+/Iba1+细胞比CX3CR1CreERT+/-组有减少的趋势，表现在STR区显著降低。由于P21天小胶质细胞数量达到顶峰，此时三组间增殖的Iba1+细胞数量非常少，没有显著差异。从P9到P21天增殖变化来看，CX3CR1CreERT+/-组经历了Iba1+细胞增殖急速下降的趋势，而HDAC3-miKO-D小鼠Iba1+细胞增殖一直处于低于CX3CR1CreERT+/-组的状态，提示HDAC3缺失在这一过程中的独特作用。4.HDAC3-miKO-D促进了成年后脑内外周巨噬细胞增多。通过流式细胞术对P21及成年后脑内小胶质细胞进行分析结果显示:P21天，尽管没有看到明显的巨噬细胞群(CD45hiCD11b+)，但是HDAC3-miKO-D组小胶质细胞(CD45intCD11b+)中的CD45表达比WT组显著增高;而成年后则发现HDAC3-miKO-D组小鼠CD45hiCD11b+的巨噬细胞群和CD45intCD11b+小胶质细胞群的独立存在，这一现象未出现在WT组。进一步采用F4/80和Iba1免疫荧光分别标记脑内巨噬细胞(F4/80+Iba1+)和小胶质细胞(F4/80-Iba1+)，结果显示，HDAC3-miKO-D组脑内巨噬细胞显著高于WT组，而小胶质细胞的数量显著低于WT组;小胶质细胞特异性标记物P2RY12的免疫荧光染色同样证实了HDAC3-miKO-D组成年后小鼠脑内小胶质细胞数量较WT组减少。以上结果提示HDAC3-miKO-D组成年小鼠脑内Iba1+细胞数量的增多是由于外周巨噬细胞的增多。5.HDAC3-miKO-D促进了成年小鼠巨噬细胞的浸润和增殖的增加。内源性IgG渗漏评估BBB的完整性未见HDAC3-miKO-D小鼠与WT小鼠的显著差异;流式细胞术分析脑内外周单核细胞浸润情况显示，除巨噬细胞在HDAC3-miKO-D成年小鼠脑内增多外，外周的其他单核细胞(中性粒细胞、树突状细胞)与WT小鼠没有区别。qPCR检测显示HDAC3-miKO-D脑内CCL2上调。以上结果提示成年HDAC3-miKO-D小鼠巨噬细胞的浸润是一种不依赖于BBB渗透的趋化作用。有趣的是,Ki67/Iba1染色发现HDAC3-miKO-D组成年后出现了Iba1+细胞增殖升高的现象，与前面成年后Iba1+细胞增多现象相一致。流式分选后qPCR证实了成年后脑内巨噬细胞中HDAC3已经更新到WT水平，而小胶质细胞仍然保持HDAC3的缺失;Iba1/P2RY12/EdU荧光三标观察到小胶质细胞增殖(Iba1+/P2RY12+/EdU+)仍然维持在低下的水平，而巨噬细胞的增殖(Iba1+/P2RY12-/EdU+)显著高于小胶质细胞。这些结果提示，成年后巨噬细胞中的HDAC3已经恢复正常水平，其增殖不受HDAC3缺失的影响。因此，HDAC3-miKO-D导致小胶质数目减少进而促使了巨噬细胞浸润并增殖，这是造成HDAC3-miKO-D小鼠成年后Iba1+细胞数量增加的可能原因。6.HDAC3-miKO-D延缓了早期髓鞘发育成熟，却不影响成年后的白质结构和功能。在发育阶段，我们通过OPCs(oligodendrocyteprecursorcells)标志物NG2、OLs(oligodendrocytes)标志物APC、OPCs/OLs共同的标志物Oligo2以及成熟髓鞘的标志物MBP等评估髓鞘发育。结果表明:在P21天胼胝体Oligo2+细胞数量两组小鼠相当的情况下，HDAC3-miKO-D组的NG2+细胞数量显著高于WT组，与此同时，APC+细胞数量则显著低于WT组。这些结果提示发育期HDAC3-miKO-D组小鼠白质发育被抑制。我们采用成熟髓鞘标志物MBP免疫荧光染色评估成年后髓鞘的结构，结果显示胼胝体的形态结构和纹状体的形态结构HDAC3-miKO-D组和WT组之间均无显著变化。进一步采用胼胝体复合动作电位的电生理评估成年后白质的功能，结果表明HDAC3-miKO-D并不影响成年后的白质功能。这些结果提示HDAC3-miKO-D延缓了早期髓鞘发育，但不影响成年后的白质结构和功能。7.HDAC3-miKO-D导致成年后神经轴突的过度突触修剪。我们通过细胞形态分析和促炎型标记物CD16免疫荧光染色显示，HDAC3-miKO-D导致了成年后Iba1+细胞呈促炎吞噬态激活。我们将突触前后膜标记物SYN和PSD95分别与Iba1共标，分析Iba1+细胞对突触前后膜蛋白的吞噬情况，结果表明HDAC3-miKO-D促进了突触前后膜蛋白的过度吞噬。F4/80+标记巨噬细胞的结果显示了HDAC3-miKO-D小鼠脑内巨噬细胞与小胶质细胞对突触前后膜蛋白的吞噬能力相当，提示外周浸润并增殖的巨噬细胞行使了小胶质细胞样的吞噬功能。Dil和高尔基染色对成年小鼠海马的树突棘进行染色和统计，结果表明HDAC3-miKO-D促进成年后突触树突棘的丢失，表现为树突棘的总体数量下降尤其是细长型树突棘数量的下降更为显著。8.HDAC3-miKO-D对小鼠的运动功能没有影响，却导致小鼠成年后记忆功能障碍和焦虑样行为。发育期翻正反射、前肢悬挂以及成年后的转棒实验结果显示HDAC3-miKO-D对小鼠的运动功能没有影响。HDAC3-miKO-D小鼠在新物体识别实验中对新物体偏好性比WT小鼠显著下降，提示HDAC3-miKO-D导致小鼠记忆功能障碍;而旷场和高架十字迷宫结果表明，HDAC3-miKO-D显著导致了小鼠成年后的焦虑样行为，具体表现为HDAC3-miKO-D小鼠在旷场的中央区停留时间显著缩短，且在高架十字迷宫的闭合臂停留的时间延长。以上结果提示了发育期小胶质细胞中HDAC3特异性敲除可能导致小鼠的高级神经功能障碍。 研究结论:我们首次发现HDAC3-miKO-D影响了小胶质细胞发育尤其是成年后的小胶质细胞稳态维持。HDAC3-miKO-D小鼠成年后以不依赖于血脑屏障破坏的方式通过上调趋化因子促进了外周巨噬细胞浸润和增殖增加，从而促进了突触过度修剪，最终导致成年小鼠认知功能障碍和焦虑样行为。
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