摘要
帕金森病(Parkinson''sdisease,PD)是全球第二大神经退行性疾病，目前我国65岁以上的老年人群中PD发病率约为1.7％,预计到2030年，我国PD患者人数将高达500万。值得注意的是PD还具有性别差异，男性患病率大约是女性的两倍，然而在该病的发展过程中，女性患者的病情却往往表现得更加迅速和严重。PD的病理变化主要是黑质致密部多巴胺能神经元的减少和残存神经元内路易小体的沉积。此外，异常激活的胶质细胞导致的神经炎症与PD发病机制密切相关。白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是一种具有双重作用的细胞因子，既具有促炎作用又有抑炎作用，这可能与体内IL-6水平相关。较低水平的IL-6可能具有抑炎作用，能够调节多种生理过程，并发挥神经保护作用。在PD患者以及PD模型动物的脑脊液和血清中可以检测到IL-6水平升高。此外，在其他多种疾病中，研究发现IL-6信号通路与雌激素通路间存在相互作用。而在离体实验中发现，重组IL-6(RecombinantIL-6,rIL-6)可改善神经毒素1-甲基4-苯基吡啶(1-Methyl-4-pheny1-pyridinium，MPP+)对小鼠多巴胺能神经元的毒性损伤。在本课题中，我们深入研究了IL-6在PD病理中的作用。 利用Il6基因敲除(Knockout，KO)小鼠、Il6杂合子小鼠(Heterozygote，Il6HE)小鼠和野生型(Wildtype，WT)小鼠，从以下4个方面深入分析了IL-6对小鼠帕金森病病理的影响:1.雄性WT小鼠和Il6KO小鼠的PD病理表型对比;2.雌性WT小鼠和Il6KO小鼠的PD病理表型对比;3.WT小鼠和Il6HE小鼠的PD病理表型对比;4.外源rIL-6干预后WT小鼠和Il6KO小鼠的PD病理表型变化。在研究中，我们通过腹腔注射神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2,3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP),一天4针，每两针之间间隔2小时，建立急性PD小鼠模型，对照小鼠给予生理盐水(NS)。采用行为学测试、高效液相色谱技术、免疫印迹技术、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、体视学计数、小胶质细胞形态学分析等方法，在给予MPTP后不同的时间点(1天、3天或7天)对小鼠的运动协调行为、黑质-纹状体多巴胺能系统的损伤以及胶质细胞的反应性激活进行了综合分析。主要研究内容和结果如下: 1.Il6缺失在一定程度上加重了雄性PD小鼠的运动功能障碍和小胶质细胞的激活 利用雄性Il6KO小鼠和WT小鼠建立急性PD模型，MPTP给药1天、3天、7天后分别进行行为学和病理分析。行为学上，MPTP给药1天后，两种基因型小鼠在悬挂实验(Wirehangingtest)中的得分均显著下降;在爬杆实验(Poletest)中，相较于WT小鼠，MPTP给药1天后Il6KO小鼠爬杆总时间显著延长，MPTP给药7天后，Il6KO小鼠转头时间显著延长，表现出更明显的运动功能障碍。对黑质-纹状体通路开展研究，MPTP给药后，纹状体部位TH蛋白表达水平、多巴胺能神经末梢丢失、多巴胺(Dopamine,DA)神经递质及其代谢产物含量，在Il6KO和WT小鼠之间没有差异。在MPTP给药3天、7天后，两种基因型小鼠纹状体内GFAP蛋白水平显著升高，给药3天后，WT小鼠纹状体Iba1蛋白水平升高;对黑质-纹状体通路中胶质细胞的数量进行分析，发现Il6缺失并不改变MPTP引起的纹状体部位星形胶质细胞和小胶质细胞数量的增加，但MPTP给药7天后，Il6缺失导致黑质致密部小胶质细胞数量的增加更为显著。因此，在雄性小鼠中Il6缺失加重MPTP模型小鼠的运动功能障碍和小胶质细胞的激活，但不改变多巴胺神经末梢的丢失。 2.Il6缺失加重了雌性小鼠中MPTP诱导的PD病理 MPTP急性给药3天后，在爬杆实验和悬挂行为学实验中Il6缺失加重了雌性PD小鼠的运动障碍;Il6缺失加重了纹状体TH蛋白水平的下降、多巴胺能神经末梢的损伤以及黑质致密部多巴胺能神经元的丢失;Il6缺失导致MPTP诱导的星形胶质细胞的激活更加明显，纹状体小胶质细胞胞体面积显著增大，但不影响小胶质细胞数量的改变。纹状体蛋白组学结果显示，WTMPTP组和KOMPTP组差异蛋白富集的生物过程主要涉及机体炎症反应和多巴胺的合成、代谢和传递过程等;富集的信号通路主要包括cAMP信号通路、Rap1信号通路、MAPK信号通路以及PI3K-Akt信号通路等炎症相关通路。 3.Il6HE减少了PD小鼠黑质部位星形胶质细胞的激活 MPTP急性给药1天后，纹状体TH和GFAP蛋白的免疫印迹结果显示，与WT小鼠相比，Il6HE小鼠中TH蛋白水平下降的程度相近，而GFAP蛋白显著减少;通过纹状体免疫组化染色和黑质致密部免疫荧光染色结合细胞计数，我们发现与生理盐水组相比，给药后仅WT小鼠黑质致密部的星形胶质细胞数量显著增加，而Il6HE小鼠中星形胶质细胞数量没有变化;给药后，小鼠黑质-纹状体通路中小胶质细胞数量增加，但基因型之间没有显著差异。 4.rIL-6腹腔给药对PD模型小鼠具有一定的保护作用 MPTP急性给药1天后，在爬杆实验中，腹腔注射rIL-6能够减轻MPTP引起的WT小鼠运动障碍;给药3天后，在旷场实验(Openfieldtest)中，腹腔注射rIL-6后WT小鼠移动时间显著增加。免疫印迹结果显示，腹腔注射rIL-6可以减轻WT和Il6KO小鼠纹状体内TH蛋白水平的减少;免疫组织化学染色、免疫荧光染色和细胞计数的结果显示，rIL-6仅能够减轻Il6KO小鼠黑质部位星形胶质细胞的激活，但对两种基因型小鼠小胶质细胞的激活没有影响。 综上，本论文中采用MPTP建立急性PD小鼠模型，从多个层次对比分析了Il6敲除纯合子小鼠、Il6杂合子小鼠和野生型小鼠的PD病理表现，发现Il6缺失可能通过胶质细胞激活的改变加重多巴胺能系统的损害，这一现象在雌性小鼠中更为明显。腹腔注射rIL-6可以部分改善小鼠的PD病理，为PD机制研究和干预提供了新的实验依据。
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