摘要
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，是全球最常见的肝脏疾病之一。NAFLD尚无明确的治疗药物，因此筛选安全有效预防NAFLD的药物尤为重要。有研究认为天然产物橙皮苷（HDN）能够抑制脂肪蓄积，但具体作用机制不明。脂肪酸β氧化在NAFLD发展中发挥重要作用，SIRT1/PGC1α通路与脂肪酸β氧化联系密切并且在NAFLD中异常下调，是NAFLD治疗的潜在靶点。由此，本研究通过高脂饲喂建立小鼠NAFLD模型，综合评估HDN对小鼠肝脏的保护作用，并基于SIRT1/PGC1α通路和脂肪酸β氧化途径探究HDN作用机制，为研发天然药物预防NAFLD提供理论依据。 试验分为体内和体外两个部分：（1）通过高脂饲喂小鼠16周建立NAFLD模型，150mg/kg/d或300mg/kg/dHDN连续灌胃16周，每周称量小鼠体重，在第16周取血清和肝脏样本。观察小鼠肝脏病理学结构变化。生化检测小鼠血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平和肝脏中TG、TC、LDL和HDL水平。腹腔注射葡萄糖和胰岛素检测小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。非靶向代谢组学对NAFLD小鼠肝脏中代谢物水平进行分析。免疫荧光检测SIRT1水平，免疫组化检测SIRT1和PGC1α水平。免疫印迹检测肝脏SIRT1/PGC1α表达水平、脂肪酸转运合成（CD36、SCD1、FABP1）和脂肪酸β氧化（PPARα、CPT1、ACOX1、EHHADH）相关蛋白水平。（2）使用棕榈酸-油酸培养基（PO）诱导AML12细胞建立体外高脂模型，CCK-8筛选HDN干预剂量。生化检测AML12细胞TG、TC水平。油红O染色观察AML12细胞脂滴蓄积情况。细胞热迁移和分子对接检测HDN与SIRT1靶向关系。免疫共沉淀检测SIRT1和PGC1α互作关系和PGC1α乙酰化水平。免疫荧光观察SIRT1和PGC1α表达和二者共定位水平。免疫印迹检测AML12细胞SIRT1、PGC1α、CD36、SCD1、FABP1、PPARα、CPT1、ACOX1、EHHADH蛋白表达水平。 结果表明：（1）在高脂饲喂建立的小鼠NAFLD模型中，HDN能够降低高脂小鼠体重和肝指数，显著降低血清中TG、TC、LDL、AST、ALT水平，显著升高HDL水平（P＜0.05）；显著降低肝脏中TG、TC、LDL水平，显著升高HDL水平（P＜0.05）；显著提高葡萄糖耐量和胰岛素敏感性（P＜0.05）；显著改善肝细胞内脂滴数量和肝损伤（P＜0.05）。HDN调节NAFLD小鼠肝脏中牛黄鹅去氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、次牛磺酸、9-KODE、乙酰乙酸等影响脂质合成代谢的相关代谢物以及13-OxoODE和烟酰胺等影响脂肪酸β氧化相关代谢物表达。HDN激活SIRT1/PGC1α通路，显著降低脂肪酸转运合成相关蛋白（CD36、SCD1、FABP1）表达（P＜0.05），显著升高脂肪酸β氧化相关蛋白（PPARα、CPT1、ACOX1、EHHADH）表达（P＜0.05）。（2）在PO诱导AML12细胞体外高脂模型中，HDN降低AML12细胞TC、TG水平，显著减少细胞脂滴数量（P＜0.05），HDN靶向激活SIRT1显著增加PGC1α去乙酰化水平（P＜0.05），抑制脂肪酸转运合成相关蛋白（CD36、SCD1、FABP1）表达，促进脂肪酸β氧化相关蛋白（PPARα、CPT1、ACOX1、EHHADH）表达。siRNA转染敲低SIRT1表达后，抑制SIRT1/PGC1α通路，脂肪酸转运合成相关蛋白（CD36、SCD1、FABP1）表达显著增加（P＜0.05），脂肪酸β氧化相关蛋白（PPARα、CPT1、ACOX1、EHHADH）表达显著降低（P＜0.05），HDN抗脂质蓄积作用减弱。 结论：（1）HDN能够激活SIRT1促进PGC1α去乙酰化。（2）HDN通过激活SIRT1/PGC1α通路促进脂肪酸β氧化，具有降低肝细胞脂质蓄积作用。（3）HDN改善高脂饲喂诱导的小鼠NAFLD，具有保肝作用。
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