摘要
传染性支气管炎（IB）是鸡的一种高度传染性呼吸道疾病，该病在全球范围内广泛传播，给家禽业造成巨大的经济损失。传染性支气管炎病毒（IBV）是γ-冠状病毒属的代表毒株。IBVNSP5蛋白具有重要的生物学活性，其将病毒多聚蛋白水解切割成各个功能蛋白，是病毒复制过程中的关键蛋白酶，抑制其作用可有效阻断病毒的复制。本研究主要通过噬菌体展示技术筛选出能与IBVNSP5蛋白特异性结合的亲和多肽，并探究在体内和体外的抗病毒作用。 本实验构建成功原核重组表达质粒pGEX-IBV-NSP5，在低温条件下经IPTG诱导，可获得高丰量的水溶性表达重组蛋白。以IBVNSP5纯化蛋白免疫新西兰白兔，制备其多克隆抗体，ELISA抗体效价为219，并且与IBV和IBVNSP5真核表达蛋白有良好的反应性。 以纯化IBVNSP5蛋白为靶分子，对其进行噬菌体展示十二肽库的五轮生物淘选，第四轮时进行了pGEX-6P-1载体标签蛋白的消除筛选。测定选取的30个亲和噬菌体的核苷酸序列并推导其氨基酸序列，共获得11条亲和肽。选择重复性和亲和性较高的3个多肽进行合成，分别是ALTQSRTWLGGP、HSPVRGLWIGPP和WGFNTHAPHNRW，命名为A、H、W多肽并进行抗病毒作用研究。 体外抗病毒研究中，实时荧光定量RT-PCR和间接免疫荧光检测表明3个亲和多肽均可抑制IBV在CEK细胞中的复制增殖。其中A和H肽抗病毒效果明显高于W肽，且以亲和多肽与病毒共孵育再感染细胞的方式抑制病毒效果最好，同时还观察到亲和多肽的抗病毒作用有明显的剂量依赖性。体内亲和噬菌体抗病毒研究表明，亲和噬菌体A和H处理组能显著或极显著降低IBV感染鸡气管、肺脏和肾脏的病毒载量，减轻IBV感染鸡的临床症状和病理组织学损伤，有很好的抗病毒作用。 将H、A和W亲和多肽与IBVNSP5蛋白进行分子对接。通过Swiss-model、ChemDraw和Chem3D软件构建出NSP5蛋白和3个亲和多肽的结构模型，通过Autodockvina软件进行分子对接。结果显示H肽和A肽相较于W肽都具有较强的与IBVNSP5蛋白结合能力，且主要依赖于氢键和疏水作用力。通过亲和多肽结合位点与IBVNSP5蛋白氨基酸序列比对分析，初步确定Leu5和Asn298是其结合活性位点。 综上，本实验成功表达和纯化了IBVNSP5重组蛋白，噬菌体展示技术筛选出11个亲和多肽，其中H肽和A肽在体内和体外实验中均能显著抑制IBV病毒的复制，这一发现为抗IBV小分子多肽制剂及阻断药物的研发提供了坚实的理论依据。
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