摘要
目的：探讨百合地黄汤对对氯苯丙氨酸（PCPA）和咖啡因联合多因素焦虑刺激所致失眠小鼠的镇静安神作用及其机制。 方法：（1）120只昆明小鼠随机分为5组：正常组、地西泮组、百合组、地黄组和百合地黄汤组（简称复方组）。各给药组小鼠灌胃相应药物，正常组灌胃0.9%生理盐水，连续7d。给药前及给药期间采用Morris水迷宫实验系统观察小鼠的学习认知能力。末次给药45min后，各组随机取12只小鼠，腹腔注射3.5mg·kg-1戊巴比妥钠溶液，观察30min内的入睡只数，计算睡眠发生率；每组剩余12只小鼠腹腔注射4.5mg·kg-1戊巴比妥钠溶液，观察睡眠潜伏期和睡眠持续时间。（2）120只昆明小鼠随机分为6组：正常组、模型组、地西泮组、百合组、地黄组和百合地黄汤组（简称复方组）。采用腹腔注射PCPA和咖啡因结合多因素焦虑刺激共同制备失眠小鼠模型。模型复制成功后各给药组给予相应药物干预治疗，连续7d。实验过程中通过Morris水迷宫观察各组小鼠的学习认知能力。给药第6天，戊巴比妥钠实验观察睡眠发生率、睡眠潜伏期和睡眠持续时间。给药第7天，目内眦取血，迅速分离海马、皮质、下丘脑、垂体。酶联免疫吸附染色(ELISA)法检测血清去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五羟色胺(5-HT)含量以及垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)、下丘脑促肾上腺皮质激素释放素(CRH)含量；用HE染色法观察海、视交叉上核的病理形态学变化；免疫组化法观察中缝背核5-HT蛋白表达、海马脑源性神经营养因子（BDNF）、视交叉上核Bmal1和Clock的蛋白表达；QRT-PCR法检测海马和皮质中环磷腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）、cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的基因表达；Westernblot法检测海马和皮质中cAMP、PKA、CREB、磷酸化CREB（p-CREB）的蛋白表达。 结果：1.百合地黄汤对正常小鼠的镇静安神作用：各给药组均能明显提高实验小鼠的睡眠发生率、缩短睡眠潜伏期；除百合组外，各给药组均能显著延长睡眠持续时间（P＜0.01）。水迷宫实验结果表明，给药后，地西泮组、百合组和复方组能增加实验小鼠的逃避潜伏期，地西泮组、百合组和地黄组能减少实验小鼠的游泳总路程。 2.百合地黄汤对失眠小鼠的镇静安神作用：与正常组比较，模型组小鼠睡眠潜伏期大幅的延长（P＜0.01），睡眠持续时间也大幅地缩短；逃避潜伏期及总路程延长；收缩压升高、舒张压下降、心率上升；HE染色发现海马锥体细胞减少、排列散乱。与模型组比较，各给药组小鼠睡眠发生率升高，睡眠潜伏期缩短（P＜0.05,P＜0.01），睡眠持续时间延长；逃避潜伏期及总路程缩短；收缩压降低、心率下降，其中复方组的心率显著降低（P＜0.01）；HE染色发现海马锥体细胞增多、排列整齐。 3.百合地黄汤对神经递质的调节作用：与正常组比较，模型组小鼠血清DA、垂体ACTH、下丘脑CRH含量升高，血清5-HT含量降低（P＜0.01）；脑组织5-HT蛋白表达下降（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组小鼠血清DA、垂体ACTH、下丘脑CRH含量降低，血清5-HT含量升高（P＜0.05,P＜0.01），复方组小鼠血清NE含量降低（P＜0.05）；脑组织5-HT蛋白表达升高，复方组其蛋白表达升高最为显著（P＜0.01）。 4.百合地黄汤对cAMP/PKA/CREB信号通路的调控作用：与正常组比较，模型组小鼠视交叉上核星形胶质细胞数量增多、体积变大；脑组织BDNF、Bmal1、Clock蛋白表达降低（P＜0.05,P＜0.01）；海马和皮质中cAMP、PKA基因蛋白表达下降，p-CREB蛋白表达下降（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组小鼠视交叉上核星形胶质细胞数量减少、体积变小；脑组织BDNF、Bmal1、Clock蛋白表达升高（P＜0.05,P＜0.01）；cAMP、PKA基因表达升高（P＜0.05,P＜0.01），皮质中地黄组PKA基因表达下降；cAMP、p-CREB、PKA蛋白表达升高（P＜0.05,P＜0.01），皮质中百合组、地黄组PKA蛋白表达降低。 结论：百合地黄汤能有效缩短失眠小鼠睡眠潜伏期，延长睡眠持续时间，提高睡眠发生率，改善焦虑行为，可能是通过调节生理节律基因Bmal1、Clock的表达，同时调节cAMP/PKA/CREB信号通路，影响脑神经递质含量来共同发挥镇静安神作用的。
NETL