摘要
背景和目的：动脉粥样硬化易损斑块破裂及继发急性血栓形成是导致急性冠脉综合征的主要原因。易损斑块的主要特征包括薄纤维帽、脂质坏死核心、大量炎症细胞、微钙化、新生血管和斑块内出血（IntraplaqueHemorrhage,IPH）等。然而，动脉粥样硬化易损斑块的破裂机制尚不完全清楚，目前也缺乏精准检测动脉粥样硬化易损斑块的影像学手段。髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）是一种由巨噬细胞和中性粒细胞合成分泌的炎性蛋白酶，是参与动脉粥样硬化的重要炎症因子。既往文献报道，MPO可能通过诱导内皮细胞凋亡和内皮功能障碍参与斑块侵蚀。但是，MPO对动脉粥样易损斑块的具体作用机制尚不完全清楚。因此，本研究旨在探究MPO调节动脉粥样硬化斑块易损性的作用机制，特别是MPO通过作用于内皮细胞调节新生血管和IPH的具体机制，明确抑制MPO活性对易损斑块的稳定作用；设计靶向活性MPO的分子影像探针，实现动脉粥样硬化活性MPO的分子影像；此外，应用新型影像学方法成像易损斑块IPH，用于动脉粥样硬化易损斑块的成像识别和动态监测。 方法： （1）收集30例人颈动脉内膜剥脱术后的颈动脉斑块组织用于本研究。建立2种动脉粥样硬化易损斑块动物模型：ApoE-/-小鼠高脂饮食40-42周构建腹主动脉易损斑块模型、高脂饮食的ApoE-/-小鼠予以连续狭窄（TandemStenosis,TS）手术构建右颈动脉易损斑块模型。建立基质胶嵌入活性MPO动物模型：C57BL/6J小鼠腿部肌肉注射MPO与葡萄糖氧化酶的基质胶混合物。 （2）靶向活性MPO的5-HT-Fe3O4-Cy7纳米探针合成是将5-HT、Cy7-NHS和Fe3O4@PEG-COOH通过化学修饰法偶联，并利用透射电镜、马尔文粒径分析仪、紫外分光光度计、荧光分光光度计、荧光成像系统、磁粒子成像扫描仪对5-HT-Fe3O4-Cy7纳米探针进行表征分析。 （3）通过磁粒子成像（MagneticParticleImaging,MPI）、荧光成像（FluorescenceImaging,FLI）、计算机断层扫描成像和核磁共振成像，实现活性MPO的分子影像和IPH成像，小鼠血管离体光片显微成像评估斑块新生血管渗透性和斑块体积。 （4）Westernblot、qPCR、病理染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色分析斑块各种成分，包括MPO、巨噬细胞、T淋巴细胞、平滑肌细胞、单核细胞趋化蛋白-1、新生血管、IPH、钙化、胶原纤维、血小板、纤维蛋白、红细胞、血红蛋白和铁蛋白。 （5）用Cellcountingkit-8实验评估探针对巨噬细胞的毒性，用离体巨噬细胞吞噬红细胞的方式来获取含铁血黄素，并用MPI和透射电镜对其进行扫描。 结果： （1）MPO在动脉粥样硬化易损斑块的作用：ApoE-/-小鼠高脂饮食40-42周，腹主动脉斑块比主动脉弓斑块有更高的易损性，包含更多的巨噬细胞、新生血管和微钙化（P＜0.05）。MPO在腹主动脉斑块含量显著高于主动脉弓斑块（P＜0.05）。抑制MPO活性不能减少斑块大小，但可以显著减少腹主动脉斑块的巨噬细胞、平滑肌细胞和单核细胞趋化蛋白-1（P＜0.05）。 （2）靶向活性MPO纳米探针的合成与表征：靶向活性MPO的5-HT-Fe3O4-Cy7纳米探针分散性好、稳定性强、大小均一，粒径约为20.97±2.23nm。5-HT-Fe3O4-Cy7探针浓度与体外MPI信号和体外FLI信号均表现为线性关系，证实其具有MPI和FLI双模态成像功能。细胞和动物实验初步证实5-HT-Fe3O4-Cy7纳米探针的生物安全性，探针在体内主要分布于肝脏和脾脏。体外和体内靶向实验证实5-HT-Fe3O4-Cy7纳米探针在活性MPO的作用下可发生团聚蓄积，实现活性MPO的MPI/FLI分子影像成像。 （3）动脉粥样硬化活性MPO的MPI/FLI分子影像：高脂饮食40-42周的ApoE-/-小鼠静脉注射5-HT-Fe3O4-Cy7纳米探针，24小时后MPI/FLI成像发现腹主动脉斑块MPI信号（P＜0.001）和FLI信号（P＜0.05）显著高于主动脉弓斑块，说明5-HT-Fe3O4-Cy7纳米探针可以通过MPI/FLI分子影像来检测易损斑块。此外，药物抑制MPO活性显著降低腹主动脉斑块的MPI信号（P＜0.005)和FLI信号（P＜0.05)，说明5-HT-Fe3O4-Cy7纳米探针联合MPI/FLI分子影像可监测动脉粥样硬化药物干预下的斑块MPO活性。 （4）MPO调节动脉粥样硬化IPH的作用机制：高脂饮食的ApoE-/-小鼠行TS手术构建了右颈动脉的易损斑块，其斑块成分包括IPH、新生血管、炎症细胞、管腔内微血栓和坏死核心等。在人和鼠颈动脉斑块组织中，MPO与新生血管共定位的部位存在IPH。抑制MPO活性对颈动脉易损斑块的新生血管数量和管腔大小无明显影响，但可以下调内皮细胞损伤标志物vWF（P＜0.01），降低新生血管渗透性（P＜0.05)，并减少IPH面积（P＜0.0001)。 （5）MPI无标记成像动脉粥样硬化IPH：人颈动脉内膜剥脱术后血管组织的IPH部位可以检测到内源性MPI信号。体外实验证实斑块内源性MPI信号可能来源于血红蛋白降解产物——具有超顺磁性的含铁血黄素，这使得MPI无需外源性造影剂就能够成像IPH。动物实验证实MPI可以活体成像ApoE-/-小鼠右颈动脉易损斑块的IPH，其MPI信号显著高于头臂干稳定斑块（P＜0.01）和左颈动脉正常血管（P＜0.01），说明MPI可以通过IPH成像识别易损斑块。MPI结合光片显微成像连续监测右颈动脉易损斑块的IPH和新生血管渗透性，发现IPH在TS术后4、7、11周表现出先增加后减少的动态变化，这种IPH动态变化可能与新生血管成熟分化导致的渗透性改变有关。此外，TS术后4周的小面积IPH可以被MPI检测，而核磁共振成像难以检测。 结论： （1）MPO在动脉粥样硬化易损斑块高表达，MPO通过诱导内皮细胞损伤和增加新生血管渗透性，促进IPH形成，从而增加动脉粥样硬化斑块易损性。抑制MPO活性可以减少IPH、巨噬细胞、平滑肌细胞和单核细胞趋化蛋白-1，从而降低斑块易损性，稳定易损斑块。 （2）5-HT-Fe3O4-Cy7纳米探针实现了斑块活性MPO的MPI/FLI分子影像，可用于识别动脉粥样硬化易损斑块并监测动脉粥样硬化斑块的MPO活性。 （3）MPI可以实现对动脉粥样硬化IPH的无标记成像，可以用于识别易损斑块和监测IPH动态变化，具有临床应用前景。
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