摘要
目的 多发性骨髓瘤（MultipleMyeloma，MM）是常见的血液系统恶性肿瘤之一，尽管MM的治疗方法和技术在不断发展，但目前仍然无法治愈。卡非佐米（Carfilzomib，CFZ）是一种被广泛用于治疗MM的药物，但多发性骨髓瘤患者大多存在副作用和耐药性等问题。双氢青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）是一种中药，因其具有良好的抗肿瘤活性以及与其他化学药物的协同作用，近年来备受关注。然而，与单一药物相比，联合用药可提高患者的临床疗效。因此，本实验旨在探究DHA联合CFZ对多发性骨髓瘤细胞株的细胞活性、增殖、凋亡及凋亡相关蛋白（P53、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3）的影响，并分析联合用药促进多发性骨髓瘤细胞株凋亡的可能机制，希望为MM的进一步体外实验和临床研究提供新思路。 方法 1、体外培养人多发性骨髓瘤细胞株ARD，用不同浓度DHA（0、5、10、20、40、80μg/mL）和CFZ（0、5、10、20、40、80nmol/L）分别处理细胞，后通过MTT实验检测细胞活力，筛选出本实验所用DHA、CFZ最佳药物浓度做后续的药物联合实验。 2、实验分组及给药方式：对照组（不做处理）、DHA组（2μg/mL）、CFZ组（8nmol/L）和联合组（2μg/mLDHA+8nmol/LCFZ），后续各实验均采用该给药方式及分组方式。 3、用MTT法检测DHA、CFZ和联合用药对ARD细胞活力的影响。 4、用CFSE掺入法检测DHA、CFZ和联合用药对ARD细胞增殖活性的影响。 5、用EdU–488法检测DHA、CFZ和联合用药对ARD细胞增殖的影响。 6、用活细胞/死细胞双染法和流式细胞术分别检测DHA、CFZ和联合用药对ARD细胞形态及凋亡的影响。 7、用蛋白质印迹法检测DHA、CFZ和联合用药对ARD细胞凋亡相关蛋白（P53、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3）表达水平的影响。 结果 1、MTT实验结果显示，DHA单药和CFZ单药均可杀伤多发性骨髓瘤细胞株ARD，与浓度呈正相关（P＜0.001）。DHA联合CFZ的联合效应值（Q值）大于1.15，说明DHA联合CFZ具有协同增效作用。对照组（不做处理）、DHA组（2μg/mL）、CFZ组（8nmol/L）和联合组（2μg/mLDHA+8nmol/LCFZ）的细胞活力的组间差异具有统计学意义（P＜0.001）；与对照组相比，用药组的细胞活力均受到抑制（P＜0.001）；与DHA组和CFZ组相比，联合用药组的细胞活力受到更显著抑制（P＜0.001）。 2、CFSE掺入实验结果显示，对照组、DHA组、CFZ组和联合组的平均荧光强度组间差异均具有统计学意义（P＜0.01）；与对照组相比，各用药组均可抑制ARD细胞的增殖活性（均P＜0.05）；与DHA组、CFZ组相比，联合组对细胞增殖活性的抑制作用更显著（均P＜0.01）。 3、EdU-488实验结果显示，对照组、DHA组、CFZ组和联合组之间的细胞增殖率组间差异具有统计学意义（P＜0.001）；与对照组相比，各用药组的细胞增殖率均下降（P＜0.001）；与DHA组、CFZ组相比，联合组的细胞增殖率下降更明显，（均P＜0.01）。 4、活细胞/死细胞双染实验显示，在明场视野下，对照组的细胞形态完整，各处理组的细胞形态均出现皱缩、碎裂，其中，联合组的细胞改变最为明显；在荧光视野下，对照组的细胞只显示绿色荧光，在各用药组中，均出现红色荧光，其中，联合组中红色荧光细胞所占百分比最大。 5、流式细胞术实验结果显示，对照组、DHA组、CFZ组和联合组的细胞凋亡率的组间差异具有统计学意义（P＜0.001）；与对照组相比，各用药组的细胞凋亡率均升高（P＜0.01）；与DHA组、CFZ组相比，联合用药组的细胞凋亡率升高更显著（均P＜0.001）。 6、蛋白质印迹实验结果显示，DHA组、CFZ组和联合组的Cleaved-Caspase-3、P53、Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平下降，4种蛋白组间差异均具有统计学意义（均P＜0.05）；与对照组相比，各用药组的Cleaved-Caspase-3、P53、Bax蛋白表达水平均升高，Bcl-2蛋白表达水平均降低（均P＜0.05）；与DHA组、CFZ组相比，联合用药组的蛋白表达水平改变更显著（均P＜0.05）。 结论 1、DHA和CFZ对多发性骨髓瘤细胞株ARD均有细胞活性抑制作用，且呈浓度依赖性，二者联用有协同增效作用。 2、DHA联合CFZ可以协同抑制多发性骨髓瘤细胞株ARD增殖。 3、DHA联合CFZ可以显著诱导多发性骨髓瘤细胞株ARD凋亡。 4、DHA联合CFZ可以促进多发性骨髓瘤细胞株ARD促凋亡相关蛋白P53、CleavedCaspase-3、Bax的表达，抑制Bcl-2的表达，说明DHA联合CFZ可能依赖于线粒体凋亡途径中P53、Bax/Bcl-2和Caspase途径发挥促凋亡作用。
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