摘要
目的: 本研究拟通过运用网络药理学方法并结合分子对接技术，分析导师经验方补肾活血颗粒治疗帕金森病的分子机制及其生物学基础，并通过动物实验对其通路和靶点进行验证，从而探讨补肾活血颗粒治疗PD的作用机制。 方法: 1、网络药理学分析：借助于中医药系统药理学平台（TCMSP）查找补肾活血颗粒活性成分，并进行ADME筛选，从GeneCards、OMIM疾病数据获得PD相关靶点。将得到的活性成分及作用靶点与PD作用靶点相结合，得到疾病-药物共同作用靶点；并使用STRING数据分析平台，对获得的疾病-药物作用靶点构建PPI蛋白质互作网络。利用Metascape平台，对疾病-药物靶点功能与通路的富集分析，继而使用Cytoscape3.7.1构建补肾活血颗粒-帕金森病靶点-作用通路网络图；借助于AUTODOCKVina和PYMOL软件进行分子对接和可视化操作。 2、动物实验：基于网络药理学富集通路结果，通过腹腔注射MPTP建立亚急性PD模型小鼠，分为空白组、模型组和补肾活血颗粒组。补肾活血颗粒组采用补肾活血颗粒中药浓缩液灌胃，空白组和模型组予以等量蒸馏水灌胃，治疗14天后，通过行为学测试观察补肾活血颗粒对PD模型小鼠运动协调能力的疗效，通过免疫组化法观察小鼠大脑黑质TH阳性表达数量，通过WesternBlot法检测网络药理富集到的PI3K/AKT通路中PI3K、AKT、Caspase9核心靶蛋白的表达水平，通过免疫荧光法检测α-Syn、Tau蛋白的表达情况。 结果： 1、网络药理学结果：（1）经过ADME筛选之后，其所含化学成分数量如下：赤芍29个，川芎7个，丹参65个，当归2个，肉苁蓉6个，山茱萸20个，石菖蒲4个。补肾活血颗粒各中药靶点数目如下：赤芍121个，川芎31个，丹参666个，当归50个，肉苁蓉171个，山茱萸93个，石菖蒲75个，合并上述靶点删去重复值共有靶点201个。（2）共获得与PD有关的疾病靶点3825个。（3）通过R语言程序，对获得的补肾活血颗粒作用靶点与PD疾病靶点取交集，共得到共同靶点145个。（4）通过Metascape在线基因注释平台进行富集，富集结果表明补肾活血颗粒作用的靶点与PD的发病机制有密切的联系。补肾活血颗粒主要参与的生物学过程包括：对有毒物质的反应、对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、对无机物的反应细胞因子介导的信号通路等。参与的主要通路包括PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、内分泌抵抗等。（5）利用Cytoscape3.7.1构建“补肾活血颗粒-PD靶点-通路网络图”发现补肾活血颗粒治疗PD的核心活性成分是槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹参酮等。（6）分子对接结果显示kaempferol、luteolin、quercetin、salviolone和dihydrotanshinlactone均与PTGS1结合能最高。kaempferol与PTGS1形成氢键的氨基酸为CYS-47，luteolin与PTGS1形成氢键的氨基酸为GLN-44，quercetin与PTGS1形成氢键的氨基酸为TYR-130，dihydrotanshinlactone、salviolone与PTGS1形成氢键的氨基酸均为HIS-207。 2、动物实验结果（1）行为学检测结果：悬挂实验结果发现，与空白组相比，模型组、补肾活血颗粒组各自的悬挂实验得分均存在显著差异（P＜0.01）；与模型组相比，补肾活血颗粒组悬挂实验得分无明显差异（P＞0.05），提示模型组与补肾活血颗粒组PD模型小鼠制备成功。灌胃14天后，结果表明，与空白组相比，模型组小鼠悬挂实验得分显著减少（P＜0.01）；与模型组相比，补肾活血颗粒组悬挂实验得分显著增加（P＜0.01）。游泳实验结果发现，与空白组相比，模型组、补肾活血颗粒组各自的游泳实验得分均存在显著差异（P＜0.01）；与模型组相比，补肾活血颗粒组游泳实验得分无明显差异（P＞0.05），提示模型组与补肾活血颗粒组PD模型小鼠制备成功。灌胃14天后，与空白组相比，模型组小鼠游泳实验得分显著减少（P＜0.01）；与模型组相比，补肾活血颗粒组游泳实验得分显著增加（P＜0.01）。结果提示PD模型小鼠的悬挂实验得分显著降低、游泳实验得分显著升高，表明补肾活血颗粒可改善小鼠的运动协调能力。（2）采用免疫组化法对小鼠黑质大脑TH阳性表达数量的结果分析，结果显示空白组小鼠大脑黑质中TH阳性神经元的数量较多，染色均匀、轮廓清晰；模型组黑质TH神经元数量与空白组相 比较少，差异显著（P＜0.01），染色较浅、较淡，轮廓相对模糊；补肾活血颗粒组黑质TH神经元数量与模型组相比数量较多，差异显著（P＜0.01）。表明补肾活血颗粒可有效治疗PD模型小鼠，其作用机制可能与DA神经元保护机制有关。（3）采用WesternBlot对小鼠黑质大脑PI3K、AKT、Caspase9蛋白表达进行分析，本次实验结果显示，经补肾活血颗粒灌胃治疗后，补肾活血颗粒组小鼠大脑黑质PI3K、AKT的蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Caspase9蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。提示补肾活血颗粒可通过显著上调PI3K、AKT的表达，下调Caspase9的表达，表明补肾活血颗粒可激活PI3K/AKT信号通路，抑制Caspase9的表达，从而起到神经元保护作用。（4）采用免疫荧光法对小鼠大脑黑质α-Syn、Tau蛋白表达结果进行分析，与空白组相比，模型组Tau表达量显著减少（P＜0.01）；与模型组相比，补肾活血颗粒组Tau表达量显著增加（P＜0.01）。与空白组相比，模型组α-Syn表达量显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，补肾活血颗粒组α-Syn表达量显著减少（P＜0.01）。表明补肾活血颗粒可有效减轻α-Syn在PD模型小鼠大脑黑质的异常聚集，以及可有效减少Tau的过度磷酸化，从而发挥对神经元的保护作用。 结论： 1、通过网络药理分析可以发现，补肾活血颗粒治疗PD的核心活性成分是槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹参酮等；主要靶点有PTGS2、PTGS1、SCN5A、ADRB2和CHRM1等；主要信号通路有PI3K/AKT、Toll样受体信号等，其功能主要为调控细胞凋亡和神经炎症反应。 2、补肾活血颗粒能有效改善亚急性PD模型小鼠运动功能，还可能通过激活PI3K/AKT信号通路，抑制Caspase9的活化来抑制细胞凋亡进程；并有效减轻α-Syn在PD模型小鼠大脑黑质的异常聚集，以及可有效减少Tau的过度磷酸化，从而发挥对神经元的保护作用。
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