摘要
恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，癌症已经成为导致死亡的首要因素，公共卫生负担也在迅速增加。作为治疗癌症主要策略的化疗，由于其严重的毒副作用和严峻的耐药问题，导致其治疗效果较差。光动力疗法（PhotodynamicTherapy，PDT）可以有效提高癌细胞的化学敏感性，从而可以减少化疗药物的使用剂量。化学-光动力疗法（chemo-photodynamictherapy）是一种将化疗与PDT相结合以产生协同互补效应的策略，被认为是一种很有前景的癌症治疗策略，在肿瘤治疗领域具有广阔前景和重要的科学意义。 1.新型β-咔啉/呋喃丙二腈光敏剂的设计、合成及化学-光动力协同抗肿瘤活性的研究 目的：β-咔啉是一类天然生物碱，具有一定的抗肿瘤作用以及荧光特性。前期已经开发了几种具有突出抗肿瘤功效的不同系列的β-咔啉衍生物。然而，β-咔啉在光动力治疗方面报道很少，因此有必要研究β-咔啉类光动力抗肿瘤活性。前期已经发现，β-咔啉天然平面三环共轭骨架可作为富电子供体（D），若将其与强电子受体2-二氰亚甲基-3-氰-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃TCF（A）通过乙烯基偶联，形成给体-π-受体（D-π-A）骨架，从而设计合成新型光敏剂10a-i，期望其具有增强的光动力效应和化疗选择性。 方法：在合成方面，通过Pictet-Spengler反应，KMnO4氧化反应，亲核取代，酯还原，DMP氧化反应，Knoevenagel缩合等多步反应得到目标化合物10a-i。关键中间体和目标物的结构经1HNMR、13CNMR和HRMS表征。考察目标化合物的光动力特性，对优选化合物10f进行光动力机制研究，并从治疗角度，进行体内外多层次的应用研究和评价。 结果：光谱性质：光敏剂10a-i的紫外波长位于400~500nm处，荧光波长在600~700nm之间。此外，在不同的pH值下评估了它们的pH响应性，其中10f表现最优异，在630nm（pH=4.5）处的荧光强度（FI）比pH=7.4时提高了近8倍。因此，10f的荧光表现出高度的pH依赖性。 光动力特性：在pH为4.5和7.4时评估了10a-i的1O2生成，其中10f在光照后表现出最高的1O2水平。利用不同的ROS探针还发现10f可以诱导?O2-和?OH的生成。光稳定性实验表明10f具有良好的光稳定性，适用于PDT。 体外化学-光动力活性：通过MTT法评估并比较10a-i的细胞毒性和光动力治疗活性，其中化合物10f对HepG2细胞的抗增殖活性最强，在孵育24和72h后表现出最高的细胞毒性和光动力治疗活性。此外，10f在缺氧环境下具有较高的抗增殖活性（IC50=5.2μM），显示出克服缺氧的化学光动力治疗的优势，同时10f可选择性抑制肝癌细胞增殖，对肿瘤细胞的抑制作用比正常细胞AML12强5.8倍。 光动力机制研究：10f具有多种细胞死亡途径，不仅能显著诱导细胞凋亡，还能诱导细胞自噬，具有克服缺氧的化学光动力治疗作用。 体内化学-光动力疗效：10f在小鼠体内的LD50高达1415mg/kg，具有非常高的体内生物安全性，在HepG2荷瘤模型中，光照情况下10f可以明显抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率为80.6%。 结论：化合物10f具有pH依赖的1O2量子产率，在人类癌细胞中表现出细胞毒性和Ⅰ/Ⅱ型PDT效应，还可以选择性地抑制肝癌细胞的增殖，而对正常肝细胞几乎没有影响，在体内发挥协同化学光动力治疗作用，毒性相当低，具有很高的临床转化价值。 2.新型β-咔啉/氰基异黄酮、氰基环己酮、萘吲哚光敏剂的设计、合成及化学-光动力抗肿瘤活性研究 目的：除了强吸电子基团呋喃丙二腈外，氰基异黄酮、氰基环己酮、萘吲哚鎓盐三个不同类型的强吸电子基团据报道可以提高整个分子活性氧生成。因此，将这三个强吸电子受体（A）通过乙烯基与富电子供体（D）β-咔啉偶联，构成D-π-A骨架，以达到延长β-咔啉共轭体系的效果。同时，在β-咔啉母环的6位引入不同的供电子基团，进一步增强分子内电荷转移，从而设计合成β-咔啉/氰基异黄酮系列11a-g、β-咔啉/氰基环己酮系列14a-f和β-咔啉/萘吲哚系列16a-e，期望它们具有化学治疗与光动力协同抗肿瘤作用。 方法：目标物11a-c、14a-b和16a通过Pictet-Spengler反应，KMnO4氧化反应，经典亲核取代反应，LiAlH4酯基还原反应，DMP氧化反应，Knoevenagel缩合反应获得。目标物11d-e和16b通过中间体6d的溴代反应，Knoevenagel缩合反应获得。目标物11f-g和16c通过中间体12的Buchwald-Hartwig偶联反应，Knoevenagel缩合反应获得。目标物14c-d和16d通过中间体6d的硝化反应，Knoevenagel缩合反应获得。最后由目标物14c-d和16d通过硝基还原反应获得目标物14e-f和16e。关键中间体和目标物的结构经1HNMR、13CNMR和HRMS表征。评估并比较各目标物的光谱性质以及光动力特性，再通过不同癌细胞评价各目标化合物的细胞毒性与光动力治疗活性，并对优选化合物11c进行抗肿瘤机制研究。 结果：光动力特性：目标化合物的紫外吸收在波长约为420~610nm之间。荧光波长在520~750nm之间。β-咔啉/氰基异黄酮系列11a-g：使用DPBF探针评估11a-g的1O2生成情况，11c在光照后表现出最高的1O2量子产率，达到0.92。利用不同的ROS探针还发现11a-g可以不同程度的诱导?O2-生成，其中11c具有最高的?O2-生成。光稳定性实验表明11c具有良好的光稳定性，适用于PDT，发挥Ⅰ型和Ⅱ型PDT的作用。β-咔啉/氰基环己酮系列14a-f：通过不同探针研究总ROS、1O2与?O2-生成情况，发现整系列表现出较弱的光动力特性，其中14c在光照后表现出最高1O2量子产率，仅有0.22。β-咔啉/萘吲哚系列16a-e：使用DCFH探针评估16a-e的总ROS生成情况，发现16c与16e具有较强的总ROS生成。采用DHE探针发现16c与16d的?O2-生成能力在系列化合物中最突出。最后，评估16a-e的1O2生成，发现整体表现出较弱的1O2量子产率。 体外抗肿瘤活性：在结合各目标化合物的光动力性质基础上，通过MTT法评估并比较β-咔啉/氰基异黄酮系列优选化合物11b-g和β-咔啉/萘吲哚系列16a-e的抗肿瘤活性。β-咔啉/氰基异黄酮系列11b-g：其中化合物11c对HT29细胞表现出最强的光毒性，IC50值可达4~5μM。11c在缺氧条件下具有与在常氧条件下相似的细胞毒性和光毒性，显示出克服缺氧的化学光动力治疗的优势，更重要的是，11c具有对结肠癌细胞选择性光动力治疗作用，而对正常结肠细胞CCD841毒性较小。β-咔啉/萘吲哚系列16a-e：整体表现出不佳的细胞毒性与光毒性。 光动力机制研究：通过检测与铁死亡相关的指标（GSH、脂质过氧化和GPX4）的水平。证明优选化合物11c可以通过诱导铁死亡来阻止肿瘤细胞增殖和转移发挥PDT的作用。 结论：光敏剂11c在保留β-咔啉天然抗肿瘤活性的基础上，同时具有Ⅰ型和Ⅱ型光动力效果，对结肠癌细胞具有选择性光动力治疗作用，通过诱导铁死亡途径发挥协同化学光动力治疗作用。因此，11c对于缺氧肿瘤的治疗具有独特的优势，表现出非常高的应用潜力。 综上所述，本文在保留β-咔啉天然抗肿瘤活性的基础上，对其结构进行修饰改造，共设计合成了27个新型光敏剂，其中，10f与11c表现出卓越的化学-光动力效果。这些结果鼓励对β-咔啉进行更深层次的探索研究。相信这一研究将为开发新型基于β-咔啉的光敏剂奠定重要基础，并对缺氧肿瘤的治疗提供更高效、低毒的方案。
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