摘要
研究背景：肺纤维化是一种慢性、进行性、不可逆性的肺间质组织异质性疾病，健康肺组织被病理性的细胞外基质所取代，引起肺泡结构破坏，肺顺应性下降，最终因呼吸衰竭而死亡。炎症和免疫紊乱被认为是肺纤维化发生、发展的主要因素，受巨噬细胞在炎症和免疫疾病过程中关键作用的启发，特别是能够介导和应答纤维化相关的炎症刺激和免疫因子，将巨噬细胞作为抗纤维化药物的递送载体显示出潜在的应用价值。白细胞介素-10（IL-10）是一种有效的抗炎、抗纤维化细胞因子，这使其成为肺纤维化极具吸引力的治疗候选药物。研究显示，转化生长因子-β1（TGF-β1）是肺纤维化发生与发展中发挥关键作用的介导因子，其主要与转化生长因子-β1Ⅱ型受体的胞外结构域（Ex-TβRⅡ）结合，从而激活下游信号转导致肺纤维化发生。有文献报道，通过使用TGF-βⅡ型受体(TβRⅡ)或抗TGF-β1抗体，阻断TGF-β1与Ex-TβRⅡ的结合，成为改善肺纤维化的一种选择。 实验目的及方法：我们设计了如下实验方案：一、建立博莱霉素（bleomy-cin，BLM）诱导的小鼠肺纤维化模型：6-8周龄雄性Balb/C小鼠，以滴鼻的方式分别在第1天和第3天给予总剂量为1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg的BLM，通过观察小鼠的一般状态、体重变化及肺部纤维化病理损伤评分，羟脯氨酸含量，评估不同给药浓度对小鼠肺纤维化的影响。二、构建两种抗纤维化工程巨噬细胞：IL-10和TGF-βⅡ型受体具有潜在的抗纤维化作用，本研究以pCDH-RP-TβR2-Fc和pCDH-mIL10-Myc质粒构建报告载体，将pCDH-RP-TβR2-Fc插入经XbaI和BamHI双酶切后的载体pCDH-mCherryP的多克隆位点中；将pCDH-mIL10-Myc插入经BamH1和Not1双酶切后的pCDH-X-GFP-Puro载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆，酶切及测序鉴定正确的pCDH-RP-TβR2-Fc和pCDH-mIL10-Myc质粒。利用慢病毒包装系统，将pCDH-RP-TβR2-Fc和pCDH-mIL10-Myc及作为对照的空载质粒pCDH-X-GFP-Puro转染人胚胎肾上皮细胞（293FT细胞），包装出慢病毒，感染小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7细胞），利用嘌呤霉素进行抗性筛选，建立可稳定表达IL-10和TβR2-FC的巨噬细胞，命名为RAW-IL10细胞和RAW-TβR2-FC细胞。利用Westernblot和ELISA的方法检测细胞培养上清中IL-10和TβR2-FC的表达和分泌水平。三、工程化巨噬细胞对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的治疗作用：将6只6-8周龄雄性Balb/C小鼠（SPF级）随机分为正常对照组（NT组）和BLM染毒组。BLM染毒组小鼠，经鼻给予5mg/kg的BLM，每只50ul，分别于造模后的第1天、第7天经鼻分别滴入PBS、RAW-Con细胞（使用空载质粒包装慢病毒感染RAW264.7细胞后获得）、RAW-IL10细胞和RAW-TβR2-FC细胞1×106cells，每只50uL。按给药时间及所给细胞的不同将BLM染毒组小鼠随机分为5个亚组（PBS组，RAW-Con组，RAW-IL10细胞治疗组，RAW-TβR2-FC细胞治疗组，RAW-IL10+RAW-TβR2-FC混合治疗组），每组6只。以21天作为实验终点。21天后颈椎脱臼法处死小鼠，解剖双肺，左肺置于10%福尔马林中固定，用于组织病理学分析；右肺用组织剪剪成细小碎块，分别用于提取RNA进行QPCR检测各组肺组织中COL1A1、α-SMA、FSP-1、Vimtin的mRNA表达情况。用Westernblot检测各组肺组织中α-SMA、COL1A1的蛋白表达情况，以及进行羟脯氨酸含量检测。 实验结果：一、经鼻滴入BLM可成功构建小鼠肺纤维化模型，实验中我们发现，相比于一次性给药法，将BLM分两次重复给药的方法建立的小鼠纤维化模型更为稳定，且经鼻给药相较于传统的气管内给药方式对小鼠损伤程度小，操作简单。随着给药剂量的增加，小鼠肺纤维化程度逐渐加重，表现为耸毛、活动减少、呼吸急促、进食减少、体重下降，肺组织病理损伤评分增加，BLM染毒组与正常对照组相比，羟脯氨酸含量明显升高；但在BLM染毒组小鼠中，给予1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg的BLM致伤后，检测羟脯氨酸含量各组之间差异不明显。由此可根据实验需要设计不同剂量浓度的BLM给药方案。二、成功构建稳定表达IL-10和TβR2-FC的工程化巨噬细胞，Westernblot可检测到细胞及培养上清中IL-10、TβR2-FC的表达。TβR2-FC可拮抗TGF-β诱导的TGF-β/Smad信号传导通路，从而起到抑制纤维化的作用。将RAW-TβR2-FC的细胞培养上清液与MLE细胞共培养，然后加入TGF-β刺激，利用Westernblot检测Smad2/3及Phospho-Smad2/3(p-Smad2/3)的表达水平验证TβR2-FC对TGF-β的拮抗作用。结果表明，加入RAW-TβR2-FC细胞上清液的MLE细胞，p-Smad2/3表达被抑制，说明本实验所构建的工程化巨噬细胞RAW-TβR2-FC可稳定表达TβR2-FC，并发挥拮抗TGF-β/Smad信号转到通路的作用。利用ELISA检测构建的RAW-IL10细胞上清中IL-10的分泌水平，结果表明，在设置的6h、12h、18h、24h等不同时间点均可检测到IL-10的表达，且随着时间的延长，IL-10的分泌水平逐渐升高，再次证明本实验所构建的RAW-IL10巨噬细胞可稳定持续表达IL-10。三、小鼠BLM造模成功后，于造模后的第1天、第7天分别给予PBS、RAW-Con、RAW-IL10和/或RAW-TβR2-FC经鼻注入肺内，21天后通过对小鼠肺纤维化相关指标的检测，结果表明，与对照组（PBS组或RAW-Con组）相比，细胞治疗组羟脯氨酸含量均明显下降，且混合细胞治疗组，羟脯氨酸含量下降更为显著。给予细胞治疗后，小鼠肺组织病理损伤评分减轻；纤维化相关标志物COL1A1、α-SMA、FSP-1的mRNA表达下降；COL1A1、α-SMA蛋白表达水平减低；肺组织中IL-10的含量明显升高，TGF-β的含量明显下降。 结论： 1、经鼻滴入给予小鼠5mg/kg的BLM处理21天后可成功构建小鼠肺纤维化模型，且操作简便，对小鼠损伤小。 2、创造性的应用基因工程技术，成功构建可稳定表达IL-10和TβR2-FC的工程化巨噬细胞，可有效改善小鼠肺纤维化损伤。将巨噬细胞作为递送载体，可以有效将药物输送到肺部，几乎没有系统毒性，较为安全。预计这种方法可以为靶向递送抗纤维化药物提供更好的选择，同时最大限度的减少副作用发生。 3、从临床应用出发，根据肺纤维化形成过程中不同阶段的病理生理特点，采用单一或混合细胞给药的方式研究对小鼠肺纤维化的影响，获得了较为满意的结果，为临床治疗肺纤维化提供有效参考。
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