摘要
狗牙根（CynodondactylonL.）生长迅速，根系密集，匍匐茎发达，抗逆性强，广泛应用于园林绿化、球场建设以及盐碱地的土壤修复，具有极高的生态、经济和社会应用价值。因此，研究狗牙根的生长发育历程及其对逆境的响应，并利用分子生物学的手段提高其抗逆性是至关重要的。以普通狗牙根为研究材料，首先分析了盐、遮荫及复合处理对狗牙根光合生理特性的影响，然后利用农杆菌介导的遗传转化技术实现CdPIF4基因在狗牙根中的过量表达，进而验证CdPIF4调控盐胁迫的作用机理，为狗牙根抗盐育种筛选基因资源。主要研究结果如下： （1）盐、遮荫及复合处理影响了狗牙根的株高、叶片相对含水量、叶绿素含量，引起了光合性能的变化。其中盐处理造成的伤害最严重，复合处理下狗牙根的生长状况和光合作用特性均好于盐处理。盐胁迫下，结合遮荫处理可以减轻狗牙根叶片细胞膜的损伤程度，保持了相对稳定的水分含量。同时，遮荫处理还能提高光合响应基因的转录水平，增加叶片光合色素含量，允许更多的光能被捕获，提高了光系统Ⅱ的最大光化学效率，改善了狗牙根的光合性能，从而在一定程度上缓解了盐胁迫对狗牙根的负面影响。 （2）荧光定量PCR检测CdPIF4基因在根茎叶中的表达模式，发现其主要在叶片中表达，茎次之，根中的表达量最低。利用PCR技术从狗牙根叶片中克隆到了CdPIF4基因，其CDS区由1290个核苷酸组成，编码430个氨基酸。生物信息学分析表明，CdPIF4编码含有bHLH保守结构域的亲水蛋白。 （3）将CdPIF4基因构建到PANIC-6B载体上，通过农杆菌介导的遗传转化法，获得了至少两个狗牙根转基因株系。GUS染色及PCR检测结果显示，该基因已整合到狗牙根基因组中，并通过荧光定量PCR证实其在狗牙根中过量表达。 （4）对获得的过表达CdPIF4狗牙根株系进行盐处理。表型结果显示，转基因狗牙根对盐胁迫的耐受性低于野生型。进一步测定了盐胁迫下光合相关指标，与野生型相比，转基因狗牙根叶片内光合色素含量显著降低，反应中心没有吸收和捕获更多的光能，最大光化学效率和光合性能指标PIABS和PItotal出现了显著降低。总体而言，盐胁迫下过表达CdPIF4的狗牙根光合性能并没有得到改善。因此，作为暗形态建成中的关键因子PIF4在盐胁迫调控通路中有区别于遮荫的其他机制。 （5）为了进一步探究PIF4在盐胁迫调控通路中的功能，测定了其它生理指标。结果显示，在盐处理下转基因狗牙根生长受到抑制，叶片电导率及丙二醛含量更高，粗蛋白含量及抗氧化酶活性均低于野生型。此外，氧化胁迫相关基因SOD、POD和CAT在不同狗牙根株系中的表达存在差异，过表达CdPIF4降低了SOD、POD和CAT的转录水平。因此，我们推断过表达CdPIF4导致狗牙根的抗氧化能力下降，进而影响其耐盐性。
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