摘要
目的： 视网膜色素变性(RP)是一种最常见的遗传相关视网膜疾病，该病可导致患者视力进行性下降甚至失明，目前尚无有效方法能减缓疾病进程。因其高度的临床和遗传异质性，包括药物治疗、基因治疗、假体植入在内的各种方法应用于治疗RP均具有局限性。细胞移植是一种有望通过使用供体细胞替代RP患者已丧失的视网膜细胞而恢复患者视力的方法。移植的供体细胞进入宿主视网膜下腔(SRS)后，可迁移、整合入视网膜，与宿主双极细胞形成突触，有望重建视网膜光回路。然而，尽管大多数研究认为移植物进入SRS后并不会引起宿主的排斥反应，但移植后供体细胞的长期存活率却很低，仅有部分患者在接受移植术后视力能够一过性的提高。这也是目前移植疗法运用于临床治疗RP的一大障碍。因此，研究影响移植供体细胞在宿主中存活情况的相关因素，继而提高供体细胞的存活率对细胞移植用于治疗RP病人具有重大的意义。 近年来，许多研究致力于提高移植的供体细胞在宿主SRS中的存活率。有研究发现影响细胞存活的因素十分复杂，除细胞本身种类外，还可能与宿主局部微环境有关。现已有研究表明，视网膜损伤可以促进供体细胞的迁移和分化,其中，继发于视网膜损伤而产生的SRS中的小胶质细胞可能对供体细胞的存活具有重要的影响。因此，我们提出假设：发生退行性变的视网膜组织可能更利于供体细胞的存活，而SRS中的小胶质细胞可能对供体细胞起到了保护作用。本研究首先通过对比供体细胞分别在RP疾病模型rd1小鼠与野生型小鼠SRS中的存活率与形态，来验证发生退行性变的视网膜组织更利于供体细胞存活的假设；其次，连续观察各年龄rd1小鼠SRS中的小胶质细胞的分布及特点，并且通过生物信息学技术对SRS的微环境进行探究，为提高细胞移植成功率提供理论依据；最后，通过药物措施消除SRS中的小胶质细胞以研究rd1小鼠SRS中的小胶质细胞对供体细胞存活产生的影响。本研究探讨可能对SRS细胞移植产生影响的相关因素，为提高细胞移植的成功率提供了新的线索。 材料和方法： 首先，比较供体细胞在野生型与rd1小鼠的SRS中的存活情况，分为以下步骤进行：筛选出光感受器细胞被特异性标记红色荧光蛋白的供体小鼠，在候选移植细胞供体小鼠出生后0~7天内，通过PCR技术进行基因型鉴定，筛选出同时带有Icre基因与TdTomato基因的新生小鼠，即为供体小鼠；其次，获取供体小鼠视网膜组织并消化后制备成单细胞悬液，通过流式细胞分选术分选出荧光标记的细胞，即为待移植的供体小鼠的光感受器前体细胞；最后，采用经巩膜途径分别移植供体细胞到野生型小鼠和rd1小鼠的SRS中，在术后的第20天处死小鼠获得视网膜组织进行冰冻切片，通过免疫荧光染色方法观察移植细胞的存活、整合情况。 接下来，对rd1小鼠SRS中的小胶质细胞进行连续观察，提取并分析rd1小鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞与SRS内容物的转录组信息，为细胞移植提供理论依据，分为以下步骤进行：首先，获取不同年龄rd1小鼠(出生后14天、21天、28天、2月、3月、6月、1年)的RPE组织并铺片，通过免疫荧光染色对其中的小胶质细胞进观察；其次，通过改进的微量RNA提取技术提取不同年龄(28天、3月、6月)rd1小鼠和对照组野生型小鼠(3月)的SRS内容物与RPE细胞的RNA，并利用生物信息学技术加以分析。 最后，通过药物措施消除rd1小鼠SRS中的小胶质细胞，比较SRS中的小胶质细胞存在或被消除时SRS中移植供体细胞的存活情况：分别选取出生后1月、2月、3月的rd1小鼠，同窝小鼠随机分为实验组和对照组。实验组正常饲养，对照组给予药物措施消除SRS中的小胶质细胞；采用与上文相同细胞移植方法分别对实验组与对照组进行细胞移植。在移植术后第20天处死小鼠获得视网膜组织进行冰冻切片，通过免疫荧光染色方法观察并比较两组移植细胞的存活、整合情况。 结果： 供体细胞进入野生型小鼠SRS后引起了较强的宿主免疫排斥反应，其在野生型小鼠的SRS中难以存活；供体细胞在rd1小鼠SRS中引起的免疫排斥反应较野生型小鼠明显更轻，且存活率更高。 在rd1小鼠出生后21天，小胶质细胞开始出现SRS中，呈现出高度分枝状；28天龄rd1小鼠的SRS中的小胶质细胞达到数量最多，表现出两种不同的表型；2月至3月龄rd1小鼠SRS中的小胶质细胞数量减少，表型再次发生转变；6月龄与1年的rd1小鼠SRS中的小胶质细胞基本消失。 RPE细胞与SRS内容物RNA-seq结果提示，6月rd1小鼠与对照组的差异基因在KEGG分析中富集到移植物抗宿主病、同种异体移植排斥反应、抗原处理和呈递等通路。GSEA结果提示相比于6月龄rd1小鼠，28天龄与3月龄rd1小鼠的样本中与光感受器发育、分化相关的基因明显表达上调。 用药物PLX5622连续饲喂rd1小鼠1周后，其SRS中的小胶质细胞能够被有效消除，实验成功构建了选择性消除rd1小鼠SRS中的小胶质细胞的动物模型。 供体细胞在实验组rd1小鼠SRS中的存活率高于抑制小胶质细胞组，提示SRS中的小胶质细胞的存在能提高供体细胞的存活率。 结论： rd1小鼠的SRS相较于野生型小鼠更有利于移植的供体光感受器前体细胞存活，提示发生退行性变的视网膜组织更利于供体细胞的存活。 出生后2月与3月的rd1小鼠为进行细胞移植的最佳时间节点。此年龄rd1小鼠的SRS中的小胶质细胞表现出抗炎性表型，同时SRS微环境中相关光感受器发育、分化基因表达上调，有利于供体细胞存活。 rd1小鼠SRS的小胶质细胞对移植的光感受器前体细胞具有保护作用，有利于供体细胞的存活。
NETL