摘要
背景和目的 胃癌是全球发病数第五多、致死数第四多的癌症，对人类健康构成严重威胁。虽然手术切除是胃癌的一线治疗方法，但其疗效通常会受到局部复发、腹膜转移或远端转移的限制，尤其是对于进展期胃癌，严重降低了术后生存率。化疗和放疗是减少术后复发和转移的关键辅助治疗，但由此产生的严重全身毒性和副作用限制了术后总生存率的提高。此外，由于患者术后身体状况较弱，通常在术后3-4周进行全身化疗和放疗，这似乎错过了这段时间内清除残留癌细胞的最佳时间点。因此，探索预防胃癌术后肿瘤复发和转移的有效治疗策略仍然至关重要。 与常规静脉化疗相比，术中化疗能提供较高的腹腔局部药物浓度，及时、直接地抑制残余肿瘤细胞，且可减少全身副反应。目前临床常用的胃癌腹腔术中化疗主要包括腹腔热灌注化疗（HIPEC）和植入缓释剂化疗。虽然腹腔热灌注化疗能显著改善胃癌患者的预后，但临床效果仍然受到其昂贵的设备要求、较短的药物维持时间和不良的热灌注并发症的限制。近年来，基于缓释给药系统的术中腹腔化疗是一种有前景的治疗方案，受到越来越多的关注。介入植入缓释剂化疗（如商用氟尿嘧啶植入剂）可维持相对较长时间的腹腔内药物浓度，但其术中使用难以在病灶部位均匀分布，且需要做固定处理，生物降解缓慢，存在一定的安全性风险。因此，亟需新的更安全的胃癌术中给药系统，以改善药物局部维持时间，抑制术后肿瘤复发和转移。 5-氟尿嘧啶（5-FU）是胃癌治疗的一线化疗药物，但由于其存在血浆半衰期短（t1/2约10-20分钟）、消除快和耐药等问题而限制了临床应用。一些临床研究表明与单药治疗相比，顺铂（DDP）和5-FU联合使用能够协同增效，提高抗肿瘤效果。然而，为了获得最佳的治疗效果，往往需要对每种药物进行多个周期的全身注射，从而会引起较严重的毒性和副作用。近年来，研究者们设计了基于各种生物材料的药物递送策略用于癌症化疗，特别是可生物降解的温敏性水凝胶，具有体温响应原位成胶特性，可以无损装载和共同递送多种药物，有望延长抗癌药物在肿瘤部位的滞留时间并减少不良反应。此外，其可注射特性使其在体内使用无需复杂的植入过程，更易于操作和均匀分布。 因此，针对胃癌术中化疗和联合用药存在的上述局限性，本课题提出了一种基于生物可降解温敏性水凝胶（PDLLA-PEG-PDLLA，PLEL）的5-FU和DDP复合载药体系，于术中注射到胃癌术后的肿瘤切除创口、周围组织和腹腔，进行病灶部位持续的药物释放，用于胃癌术中辅助联合化疗，期望及时抑制胃癌术后肿瘤复发和转移，减少毒副作用，提高综合治疗效果。 方法 首先，以Sn(Oct)2为催化剂，通过开环聚合反应合成可生物降解的聚合物聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸（PDLLA-PEG-PDLLA，PLEL）。采用核磁共振氢谱（1H-NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）对其结构和分子量进行表征。在室温下通过物理混合的方式将5-FU和DDP与PLEL胶束溶液搅拌均匀得到5-氟尿嘧啶+顺铂/水凝胶（5-FU+DDP/PLEL）。采用试管倒置法和动态流变学测试研究不同PLEL聚合物浓度（10 wt%，15 wt%，20 wt%和25 wt%）的5-FU+DDP/PLEL的温度敏感性和溶胶-凝胶相变行为。 接下来，采用高效液相色谱（HPLC）和电感耦合等离子体（ICP）测定5-FU+DDP/PLEL 水凝胶中 5-FU 和 DDP 的体外释放行为。以水溶性荧光染料Cy5.5作为5-FU和DDP的模拟药物，装载于PLEL并注射到Balb/c小鼠腹腔中，考察PLEL水凝胶药物载体在腹腔中的缓释能力。 在体外的胃癌细胞抑制效果实验中，首先使用CCK8法检测5-FU、DDP或不同比例的5-FU与DDP混合物对胃癌MKN45-luc细胞的毒性。然后，通过建立 Transwell 共培养系统探究载药水凝胶对 MKN45-luc 细胞的毒性。基于Transwell共培养系统，采用活死细胞染色实验进一步考察5-FU+DDP/PLEL水 凝胶对 MKN45-luc 细胞的抗增殖作用。同时，采用流式细胞术探讨 5-FU+DDP/PLEL水凝胶对MKN45-luc细胞凋亡的影响。 在体内的胃癌腹腔化疗效果实验中，首先建立胃癌腹腔种植转移（PC）裸鼠模型，以优化药物比例和考察抗肿瘤效果。随后建立胃癌术后复发和转移裸鼠模型以评估术中给药 5-FU+DDP/PLEL 的治疗效果。最后，采用 Hamp;E 染色法考察双载药水凝胶对主要脏器的毒性，同时对肿瘤组织进行 Ki-67 染色和TUNEL染色实验。 结果 1. 通过开环聚合反应成功合成了三嵌段 PLEL 聚合物，1H-NMR 谱计算其平均分子量为4650（PEG/PDLLA比为1500/3150），GPC结果表明分子量分布呈单峰分布，多分散指数（PDI）为1.69。 2. 通过简单的物理混合方法制备了5-FU+DDP/PLEL。试管倒置法表明其具有体温响应溶胶-凝胶相转变特性。动态流变学测试表明5-FU和DDP的加入几乎不影响水凝胶的温度敏感性，成胶温度在37℃附近，成胶时间均在2分钟内。随着5-FU+DDP/PLEL水凝胶中PLEL聚合物浓度增加，水凝胶的相转变温度降低，相转变时间减小，且成胶后凝胶的模量增大。 3. 体内外药物释放试验表明 5-FU+DDP/PLEL 水凝胶具有较好的药物缓释效果，且随着PLEL聚合物浓度的增加，药物释放速率变慢。因此，优选20 wt%的PLEL水凝胶进行后续研究。 4. 体外的胃癌细胞抑制效果实验结果表明 5-FU 与 DDP 在药物比例10:1~40:1 范围内联合具有明显的协同化疗作用，5-FU+DDP/PLEL 水凝胶对胃癌MKN45-luc细胞有较强的协同抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。 5. 在对胃癌腹腔种植转移裸鼠模型的体内治疗中，优选5-FU和DDP药物比例为20:1，5-FU+DDP/PLEL水凝胶的抗肿瘤效果优于单载药水凝胶及游离5-FU+DDP联合，而且有效降低了全身毒性。 6. 在对胃癌术后复发和转移裸鼠模型的体内治疗中，5-FU+DDP/PLEL水凝胶治疗对肿瘤的相对抑制率为 88.04%，约为游离 5-FU+DDP 联合治疗（42.55%）的2.07倍，有效减少了术后肿瘤复发和转移，显著延长了生存期（约20%的裸鼠存活超过60天）。 结论 综上所述，我们成功制备了一种基于可生物降解水凝胶（ PDLLA-PEG-PDLLA，PLEL）的5-FU和DDP复合载药体系，用于胃癌术中辅助化疗。其具有良好的温度敏感性和药物局部缓释性能。5-FU+DDP/PLEL 对胃癌细胞具有协同抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。一系列体内研究表明，使用PLEL水凝胶作为局部给药载体，对提高抗肿瘤作用和减少不良副作用有很大帮助。术中给药5-FU+DDP/PLEL也能有效抑制术后肿瘤复发和腹腔种植转移，显著延长生存期，在胃癌术中化疗中具有潜在的应用。
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