摘要
研究背景： 牙周炎发生发展过程中常伴随着不可逆的软硬组织破坏及牙周稳态的失衡，是成年人牙齿脱落的主要原因。牙周炎影响全球近35亿人口，在我国30岁以上的人群牙周病的患病率超过40%。它不仅危害口腔健康，还与糖尿病、心血管疾病、早产及低体重儿、阿尔兹海默症等全身疾病密切相关。 牙周炎发生发展过程中，不同程度的氧化应激与牙周软硬组织的不可逆性损伤有着密切的关系并可互相促进。研究显示，氧化应激和细胞凋亡在牙周炎发生的早期阶段就已经出现，在牙周炎进展期显著增加，并在牙周炎的有效治疗后显著改善。氧化应激会加剧细胞的脂质过氧化、蛋白质错误折叠和功能障碍、DNA损伤和细胞器应激及损伤，加速细胞凋亡。在牙周炎的活动期，过度的氧化应激及随之而来的细胞凋亡进一步加剧了牙周组织的破坏和牙周稳态的失衡。因此，保护牙周组织或细胞免受氧化应激和氧化应激导致的细胞凋亡可能是牙周炎早期干预和治疗的有效方式。 瞬时感受器电位离子通道蛋白Ankyrin1(Transient Receptor Potential Ankyrin1，TRPA1)是瞬时感受器电位离子通道蛋白(Transient receptor potential cation channels TRPs)超家族中最大的非选择性的可透性Ca2+通道。可被冷、热、机械刺激及多种化学刺激激活。TRPA1在吸呼道炎性疾病、慢性关节炎、视网膜损伤、肥胖和糖尿病的炎症反应中发挥重要作用，其主要作用机制是通过控制细胞Ca2+内流，一方面调节Ca2+依赖的相关蛋白分子及信号通路的功能；另一方面直接影响对钙浓度敏感的细胞器的功能，如内质网应激或线粒体氧化应激启动细胞凋亡或死亡及炎症促炎细胞因子的释放。在这些炎症相关的疾病中，TRPA1作为这些疾病新的治疗靶点，其部分拮抗剂已经进入II期临床试验。因此，TRPA1拮抗剂在抗氧化应激、抗凋亡、抗炎等相关疾病的治疗中有潜在的积极意义。 TRPA1在多种牙源性细胞中表达，TRPA1在正常的牙周膜组织和细胞中具有热敏感和机械敏感特性，在炎症性疼痛、机械性痛感中发挥关键作用。但TRPA1作为与炎性疾病密切相关的离子通道，其在牙周炎中的作用尚不明确。本研究旨在探索TRPA1在牙周炎组织中的表达规律及其与牙周炎进程中的牙周组织或细胞氧化应激的关系、通过体外实验研究其对炎性牙周膜细胞的氧化应激的影响机制、通过动物实验初步探索其对牙周炎小鼠牙周局部及全身的影响及机制，为进一步探讨TRPA1在牙周炎发生发展及治疗中的临床意义提供初步的理论依据。 研究目的： 1.检测TRPA1在临床牙周炎患者和健康人群的牙周膜组织和细胞中的差异表达模式，并分析其与氧化应激和细胞凋亡的关系。 2.探索TRPA1在炎症作环境对牙周膜细胞(Periodontal ligament cells， PDLCs)氧化应激及凋亡的影响机制，主要研究对钙离子浓度敏感的内质网应激介导的细胞氧化应激过程中相关的分子机制。 3.研究TRPA1抑制剂对牙周炎小鼠牙周炎进展的影响及其可能的分子机制，及其对牙周炎小鼠的全身影响以评价其安全性，为进一步探讨TRPA1在牙周炎治疗中的临床意义提供初步的理论依据。 研究方法： 1.收集健康人群和牙周炎患者的牙周膜细胞(Periodontal ligament cells from health or periodontitis，H/P-PDLCs)，在转录水平及蛋白水平分别检测氧化应激及凋亡相关标记分子(如Caspase3，Caspase9，Bax，Bcl-2，GRP78，SOD1，SOD2)在两组之间的差异表达水平，采用流式细胞术鉴定两组牙周膜细胞的凋亡的比例。在转录水平检测两组细胞中TRPs亚家族(如TRPV1，TRPV4，TRPM8，TRPA1)的表达情况，并在蛋白水平进一步验证。采用HE染色、免疫荧光染色及免疫组化染色，鉴定健康人群和牙周炎患者的牙周膜组织(Periodontal ligament tissues from health or periodontitis，H/P-PDLTs)中，氧化应激、凋亡标记分子(PERK，CHOP，HSP70，Caspase3，Tunel)的表达，及TRPA1在两组中的表达情况，明确TRPA1与牙周炎及氧化应激的关系。 2.1.采用不同浓度的P.gLPS及TRPA1抑制剂HC030031对牙周膜细胞进行分组干预，通过荧光酶标仪检测细胞内Fura-2/AM标记的钙离子浓度变化，确定TRPA1响应P.gLPS刺激的最适浓度，及HC030031发挥作用的最适浓度。采用1ug/ml的P.gLPS刺激牙周膜细胞构建炎性牙周膜细胞，用TRPA1抑制剂对炎性牙周膜细胞进行干预，共分为3组：空白对照组(CON组)，P.gLPS组(L组、LPS组)，LPS+HC组(LH组)，分别从转录水平、蛋白水平及细胞整体水平观察PDLCs的氧化应激和凋亡的情况。 2.2.透射电镜鉴定不同组别内质网(ER)和线粒体形态、数量、结构的变化并定量分析。检测内质网应激过程中关键信号通路PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP在转录水平及蛋白水平的变化情况，采用关键信号分子PERK抑制剂GSK2656157(LG组)、CHOP抑制剂4-PhenylbutyricAcid(4-PBA,LP组)对牙周膜细胞进行分组干预，采用qRT-PCR，WesternBlot，免疫荧光，SOD、MDA活性检测，流式细胞术等方式从不同水平检测不同组别细胞的氧化应激及细胞凋亡的程度。 2.3用EGTA鳌合剂对炎性牙周膜细胞进行干预，分别从转录水平、蛋白水平检测牙周膜细胞的氧化应激程度、内质网应激程度及信号通路PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP的活化水平，评估TRPA1活化后诱发的钙离子浓度变化事件在炎症环境下TRPA1介导的牙周膜细胞的氧化应激过程中的作用。 3.采用栓丝线+涂菌法建立实验性牙周炎小鼠模型，检测TRPA1在健康小鼠及牙周炎小鼠的牙周组织中的分布和表达情况。用HC030031对牙周炎小鼠腹腔给药，将小鼠分为4组：空白对照组(CON组)，牙周炎组(Perio组)，HC03003110mg/kg组(HC1组)，HC03003130mg/kg组(HC3组)。通过Micro-CT、HE染色等检测小鼠牙周软硬组织的破坏情况。血清学检测小鼠全身炎症水平及氧化应激水平。免疫荧光、免疫组化及WesternBlot分别检测牙周膜及牙龈组织中氧化应激及细胞凋亡的情况、PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP信号通路的表达情况。对小鼠重要脏器进行HE染色评估给药后对小鼠心肝脾肺肾的影响。 研究结果： 1.与健康人群相比，牙周炎患者来源的牙周膜细胞(P-PDLCs)在转录水平及蛋白水平表达更高的氧化应激及凋亡相关分子标记物，流式细胞术显示P-PDLCs的凋亡细胞数量占比更高。HE染色显示，牙周炎患者来源的牙周膜组织中更多的淋巴细胞浸润，牙周膜细胞及纤维组织的排列紊乱。免疫组化及免疫荧光染色显示，P-PDLTs的凋亡及氧化应激标记物阳性细胞比例显著增加。与健康人群相比，牙周炎患者来源的牙周膜细胞或组织在转录水平，蛋白水平及组织水平均显著高表达TRPA1。 2.1.结果显示，1ug/mlP.gLPS能显著活化TRPA1受体并显著增加细胞内钙离子，当TRPA1抑制剂HC030031浓度为10uM时显著减少P.gLPS诱发的细胞内钙离子浓度增加。1ug/mlP.gLPS干预24小时后，显著促进PDLCs的氧化应激和凋亡，10uMHC030031能显著改善PDLCs的氧化应激和凋亡。 2.2.透射电镜结果显示，1ug/mlP.gLPS干预24小时后，牙周膜细胞内的内质网形态发生显著肿胀及脱颗粒表现，线粒体数量显著降低，并伴有线粒体嵴消失，体积增大等表现，LH组与LPS组相比，牙周膜细胞的内质网及线粒体的异常显著改善。在转录水平及蛋白水平，P.gLPS均能显著增加内质网应激关键信号通路PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP中的关键分子的表达。PERK、CHOP信号分子的抑制剂均能显著降低P.gLPS诱导的细胞氧化应激和凋亡。 2.3.EGTA组中，采用EGTA鳌合细胞外钙离子后，牙周膜细胞的氧化应激水平及凋亡水平较LPS组相比均显著降低，内质网应激程度显著下降，信号通路PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP的活化程度较LPS组显著下降。 3.TRPA1在小鼠牙周组织中无特异性表达规律，在牙周炎小鼠模型中炎症较重的沟内上皮处高表达。HC030031腹腔给药后，牙周炎小鼠牙周软硬组织的破坏吸收显著减少，外周血氧化应激水平显著下降，牙周膜组织及牙龈组织的氧化应激水平及凋亡细胞比例均显著降低，未见明显全身炎症反应及主要脏器的结构异常。 结论： 综上所述，TRPA1与牙周炎高度相关，临床牙周炎患者P-PDLC/Ts、体外炎症性PDLCs和牙周炎小鼠的牙周组织中的氧化应激、凋亡水平和TRPA1表达明显更高。TRPA1抑制剂通过下调PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP信号通路抑制内质网应激，从而降低炎性PDLCs的氧化应激及凋亡水平。TRPA1抑制能显著降低实验性牙周炎小鼠牙周组织氧化应激和细胞凋亡水平，并伴随牙周软硬组织破坏的减少，未见明显全身炎症反应及主要脏器的结构异常。因此，TRPA1被认为是牙周炎的治疗中有潜力的靶点。
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