摘要
目的 支气管哮喘是一种以喘息、气紧，短促呼吸以及气流受限为主要症状，并以气道高反应性、气道重构为特征的慢性呼吸道炎症性疾病。临床上常规采用支气管扩张剂以及糖皮质激素类药物进行对症治疗。不幸的是，哮喘慢性炎症导致的气道重构往往会造成这些常规用药敏感性越来越差。气道重构的过程中也常常伴随着血管的异常增生和重构。而哮喘炎症反应导致的血管通透性增高和内皮细胞损伤也会促进血管异常增生和重构。研究表明，血管细胞会与周围组织及细胞构成一个血管微环境，并且血管细胞产生的代谢产物和分泌的细胞因子会对微环境产生比较重要的调控作用。尽管如此，血管内皮细胞在哮喘气道重构过程中的作用仍有待研究。在本研究中，我们将探索几个问题：(1)哮喘病人的肺血管内皮细胞发生了什么样的变化；(2)构建符合临床哮喘病人症状和表型的小鼠哮喘模型；(3)在小鼠哮喘模型上探索内皮细胞在哮喘气道重构中的作用。 方法 1临床样本 在临床上共获取了3个哮喘病人肺组织样本和3个对照病人肺组织样本：(1)所有样本进行组织消化制备单细胞悬液，使用CD31抗体磁珠分选出肺血管内皮细胞后，提取mRNA进行高通量测序。 2动物实验 (1)使用卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)诱导构建小鼠哮喘模型：1)通过检测甲基乙酰胆碱(Methylacetylcholine)吸入后气道阻力变化来评估气道高反应性(Airway Hyperresponsiveness, AHR)；2)通过实时定量聚合酶链式反应(Real time-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)检测肺组织白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-4(Interleukin-4, IL-4)、白细胞介素-5(Interleukin-5, IL-5)、白细胞介素-13(Interleukin-13, IL-13)、白细胞介素-33(Interleukin-33, IL-33)的mRNA表达水平来评估炎症状态；3)通过RT-PCR检测肺组织α-SMA和CollagenⅠ的mRNA表达水平来评估气道重构程度；4)病理切片分别通过苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin, HE)染色来评估炎性细胞浸润程度，阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色(Alcian Blue Periodic Acid Schiff Stain, AB-PAS)来评估气道上皮杯状细胞化生情况，MASSON染色来评估组织胶原沉积变化；5)CD31磁珠分选肺血管内皮细胞后，通过RT-PCR来检测内皮细胞Pdk4基因表达情况。 (2)内皮特异性敲除Pdk4小鼠：1)将VE-Cad-CreERT2小鼠与Pdk4flox/flox小鼠杂交后，培育出VE-Cad-CreERT2Pdk4flox/flox小鼠；2)对VE-Cad-CreERT2Pdk4flox/flox小鼠腹腔注射他莫昔芬(Tamoxifen)来诱导血管内皮细胞特异性敲除Pdk4基因，构建Pdk4i?EC/i?EC小鼠；3)使用CD31抗体磁珠分离肺血管内皮细胞后，通过RT-PCR检测内皮细胞Pdk4表达水平和免疫荧光(Immunofluorescence, IF)染色来验证Pdk4i?EC/i?EC小鼠内皮基因敲除情况。 结果 (1)哮喘猕猴单细胞数据和哮喘病人肺内皮细胞转录组测序结果均显示，内皮细胞高表达PDK4； (2)使用OVA诱导建立的小鼠哮喘模型呈现：气道高反应性；IL-4、IL-33表达水平明显上升；气道与血管周围炎性细胞浸润增加；气道出现杯状细胞化生，粘液分泌增加；血管下胶原沉积；α-SMA和CollagenⅠ表达水平升高等现象；哮喘鼠的肺内皮细胞表达Pdk4上调； (3)使用他莫昔芬诱导小鼠内皮特异性敲除Pdk4后，RT-PCR和IF染色显示内皮细胞表达Pdk4明显下降； (4)内皮特异性敲除Pdk4后，哮喘小鼠气道高反应性降低；IL-1β、IL-4、IL-5、IL-13、IL-33的mRNA表达水平降低；气管血管周围炎性细胞浸润减弱；气道杯状细胞化生和粘液分泌降低；血管下胶原沉积缓解；α-SMA和CollagenⅠ表达水平降低。 结论 (1)PDK4在哮喘猴和人的肺血管内皮细胞中高表达； (2)OVA雾化诱导小鼠哮喘肺内皮细胞表达Pdk4上调； (3)内皮特异性敲除Pdk4后，可以缓解哮喘的气道高反应性、炎症和气道重构。
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